【目的】建立新生山羊肾小管上皮细胞(Renal tubular epithelial cell,RTECs)的分离培养方法。【方法】采集刚出生未哺乳健康山羊的肾脏,分别采用胶原酶Ⅰ和胶原酶Ⅳ消化法分离培养RTECs,选择孔径0.15mm的筛网对RTECs进行纯化,观察各组RTECs的生长情况;对分离的RTECs进行免疫组化和碱性磷酸酶染色鉴定,并进行透射电镜观察;用流式细胞仪检测RTECs的增殖周期和凋亡情况。【结果】胶原酶Ⅳ对RTECs的消化效果优于胶原酶Ⅰ,所得的细胞团块多,纯度高,细胞生长快,经孔径0.15mm的筛网过滤后,RTECs的纯度达95%以上,并可连续传至第12代。分离获得的细...

为建立理想的研究农药中毒性肾病体外细胞模型,系统考察了原代肾小管上皮细胞提取和培养的一系列关键因素,经过优化组合,提出了一种更为高效实用的原代肾小管上皮细胞提取和培养方法。通过显微镜明场观察肾小管节段组织形态和纯度,研究0.1%的Ⅰ型胶原酶、Ⅱ型胶原酶、Ⅳ型胶原酶、Ⅴ型胶原酶在15min和3h的时候对组织的消化情况以及Ⅱ型胶原酶作用0min,8min,15min,40min,1h,3h时组织消化情况。利用MTT比色法考察了鼠尾I型胶原,层粘连蛋白,基质胶对培养皿的包被情况对细胞增殖速率的影响,利用MTT比

为研究小肽转运蛋白对小肽转运和吸收机制提供细胞模型,在体外建立原代奶牛小肠上皮细胞分离的方法,采用Ⅰ型胶原酶和中性蛋白酶混合消化液对奶牛小肠组织进行消化,通过2%山梨醇进行密度梯度离心以去除单核细胞、淋巴细胞和肌细胞;用刮除法、相差消化法和96孔板单克隆方法来纯化奶牛小肠上皮细胞,从细胞形态学、细胞角蛋白18免疫荧光染色和小肠上皮细胞特异性标志蛋白来鉴定奶牛肠上皮细胞。结果表明:1)采用Ⅰ型胶原酶和中性蛋白酶联合消化奶牛小肠组织,通过2%山梨醇密度梯度离心可以获得大量的细胞团且48h发生贴壁,但是细胞贴壁

探讨了健康鲫(Carassius auratus)幼鱼肠道上皮细胞的原代培养方法。结果显示,用含有抗生素、胶原蛋白酶Ⅰ、EDTA和胶原蛋白酶Ⅳ组成的D-Hanks液消化无菌分离的鲫肠道可以获得大量细胞团及绒毛隐窝;用含有抗生素、胎牛血清(FBS)、表皮生长因子(EGF)、胰岛素的DMEM培养液进行培养,并根据肠道上皮细胞与成纤维细胞贴壁时间的差异进一步纯化,连续培养12d后可以得到纯化的肠道上皮细胞。

为研究山羊小肠上皮细胞营养吸收调控及其与肠道微生物之间的关系,提供原代细胞培养模型,采用组织块接种来获得山羊小肠上皮细胞,利用有限稀释法来克隆山羊小肠上皮细胞,并通过细胞形态学以及细胞角蛋白18、波形蛋白、肌间线蛋白和细胞生长曲线来鉴定山羊小肠上皮细胞。结果表明:1)采用组织块接种能够分离纯化得到山羊小肠上皮细胞并稳定传至大约10代;2)RT-PCR检测发现山羊小肠上皮细胞不能够表达波形蛋白和肌间线蛋白;3)在正置显微镜下观察到山羊小肠上皮细胞能够产生细胞角蛋白18绿色荧光。研究发现,培养至第8代的山羊小

以强化培育后草鱼的肠道粘膜为试验材料,采用不同消化法和离心转速梯度分离肠道粘膜细胞团,分别试验不同培养液与不同CO2浓度组合、胎牛血清浓度及细胞接种浓度时细胞生长效果,并且观察草鱼原代肠道粘膜细胞生长过程,同时采用3种细胞形态观察法、MTT检测法及相关酶活力系统评价细胞培养效果。结果表明:采用机械刮取消化法,分离转速为400 r/min,在使用M199培养液、6%CO2、15%胎牛血清、接种浓度为2×103(个/孔)条件下可批量复制草鱼原代肠道粘膜上皮细胞;细胞增殖过程符合动物原代肠道粘膜上皮细胞生长分化规律,采用荧光倒置显微镜与Giemsa染色法相结合、MTT检测法、AKP酶活力及LDH/M...

　通过有效的细胞培养方法获得山羊乳腺上皮细胞系,对这些细胞形态进行光镜观察,结果发现,细胞可形成闭合型和开放型细胞群,闭合型细胞群边界清晰,细胞之间结合紧密;开放型细胞群边界不清,细胞相互分散存在于一局限的范围内。乳腺上皮细胞与成纤维细胞混生时分区生长,界线明显;细胞之间形成许多腔状结构。纯化的乳腺上皮细胞通过单细胞悬浮后传代,部分细胞形成岛屿状聚集,部分细胞以贴壁的自由单个细胞散在形式存在。上皮细胞增殖可形成圆顶型结构,呈乳头状(称之为乳球体);乳腺上皮细胞可产生并分泌乳汁,分泌到细胞外的乳汁流动形成网状结构。山羊乳腺上皮细胞含不同的细胞类型,大多数上皮细胞呈短梭形或多角形,细胞之间紧密相靠...

为研究乳腺上皮细胞增殖和分化特性及其基因表达的分子机制 ,建立了山羊乳腺上皮细胞培养体系。用无菌手术法从健康第二胎泌乳期山羊乳腺取得组织块 ,在体外条件下用组织块法进行原代培养。基础培养液用 RPMI1 6 4 0 ,含胎牛血清 1 5 0 m L/ L,添加 EGF(1 0 μg/ L)、胰岛素 (0 .1 m g/ L)、E2 (1 μg/ L)、氢化可的松 (0 .1mg/ L)、孕酮 (1 m g/ L)、青霉素 (0 .1 g/ L)及链霉素 (0 .0 5 g/ L) ,在铺有胶原的塑料培养板上培养。从细胞接种存活率、细胞群体倍增时间、细胞生长曲线和细胞分裂指数 4个方面考察了乳腺...

[目的]本试验以犬肾小管上皮细胞(Madin-Daby canine kidney cell, MDCK)为模型，研究赭曲霉毒素A(OTA)对MDCK的毒性作用以及番茄红素(lycopene, LYC)对细胞损伤的缓解效应。[方法]将对数生长期MDCK,随机分为对照组(无添加)、OTA组(15μmol·L~(-1) OTA)、LYC组(55μmol·L~(-1) LYC)、O+L组(15μmol·L~(-1) OTA+55μmol·L~(-1) LYC),处理36 h,研究OTA对MDCK细胞结构、细胞凋亡、肾功能相关指标、氧化与抗氧化、炎性因子等指标的影响，并探讨LYC在OTA致MDCK损伤中的缓解作用。[结果]OTA作用导致细胞发生明显皱缩，细胞数量骤减；电镜结果显示OTA能够导致细胞膜破裂、细胞器出现不同程度损伤，MDCK中乳酸脱氢酶(LDH)、活性氧(ROS)水平与丙二醛(MDA)含量极显著增加(P<0.01),超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性极显著降低(P<0.01);细胞中肾功能相关指标N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶(NAG)、β2-微球蛋白(β2-MG)、肝脏型脂肪酸结合蛋白(L-FABP)、肾损伤分子1(KIM-1)、视黄醇结合蛋白(RBP)、中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(NGAL)均极显著升高(P<0.01);同时极显著增加了MDCK的肿瘤坏死因子α(TNF-α)、干扰素6(IL-6)、干扰素18(IL-18)及干扰素1β(IL-1β)的水平(P<0.01);OTA可诱导MDCK凋亡率极显著升高(P<0.01);而LYC能够有效减缓OTA造成的损伤，LYC组与OTA处理组相比形态较饱满，细胞间衔接紧密，细胞凋亡率显著下降；LDH、ROS、MDA水平(含量)降低，SOD、CAT、GSH-Px活性升高，并降低炎性细胞因子的表达。[结论]OTA能够抑制MDCK活性，改变细胞形态，导致肾功能指标、氧化与抗氧化功能与细胞炎性因子异常，加快细胞凋亡；LYC能够显著缓解OTA对MDCK的损伤。

采用3 H -TdR掺入法 ,分 3个系列分别研究了不同剂量五肽胃泌素 ( pentagastrin)对体外原代培养的牛瘤胃上皮细胞DNA合成的影响 ,五肽胃泌素受体拮抗剂丙谷胺对五肽胃泌素营养作用的影响 ,以及五肽胃泌素对新生奶公牛瘤胃上皮细胞DNA合成的影响。结果如下 :1)用终浓度 10 -11,10 -10 和 10 -9mol·L-1的五肽胃泌素分别处理成年奶牛瘤胃上皮细胞 ,使3 H -TdR掺入量增加 30 4 2 % ,2 4 2 6 %和 4 7 16 % (P

用剪切及剪切加胰蛋白酶法消化兔泪腺组织,获取兔泪腺上皮细胞,设计相应的培养基,进行组织块原代培养或混合消化原代培养,用免疫细胞化学染色进行细胞鉴定。结果表明,组织块在体外培养10 d,可见上皮样细胞从植块边缘长出,2周后泪腺上皮细胞在培养瓶底部铺成单层,经传代3次,角蛋白染色阳性细胞纯度达90%以上;用混合消化法接种的细胞生长相对较慢。结果提示:用剪切组织块进行培养的方法简便易行,易获得符合要求的兔泪腺上皮细胞。

在体外分离培养奶牛瘤胃上皮细胞,可为奶牛瘤胃生理功能和吸收机制研究和永生化奶牛瘤胃上皮细胞奠定基础。通过胰蛋白酶消化法从奶牛瘤胃组织中分离出瘤胃上皮细胞,并通过免疫细胞化学的方法检测细胞角蛋白,CCK-8检测细胞生长曲线,β-半乳糖苷酶染色鉴定细胞的衰老以及细胞染色体核型分析来鉴定瘤胃上皮细胞。结果表明:1)利用胰蛋白酶消化法可以稳定的培养出瘤胃上皮细胞并且能够在体外传代大约5代;2)通过在显微镜下进行细胞形态的观察呈单层"岛屿状";3)在荧光显微镜下细胞角蛋白抗原能够发出绿色荧光;4)奶牛瘤胃上皮细胞传

为建立一种快速分离犬原代乳腺上皮细胞的培养方案，本研究旨在从健康泌乳金毛犬的乳汁中分离原代乳腺上皮细胞，接种于两种不同的培养基后传代培养，探讨不同培养基下细胞的生物学特征，提供犬乳腺上皮细胞简单便捷的分离措施及适宜的培养方法。选取泌乳一周的金毛犬在无菌条件下收集乳汁，离心处理后得到乳腺上皮细胞，分别用完全培养基和基础培养基接种培养，经形态学对比观察，间接免疫荧光检测角蛋白8(Cytokeratin 8)表达情况，绘制两种培养基培养下的第3代乳腺上皮细胞生长曲线；探讨完全培养基培养的第6代乳腺上皮细胞的冻存复苏活力。结果表明：1)乳汁分离可得到大量细胞团块，分别接种两种培养基后都会出现“煎蛋样”贴壁细胞，消化传代后两者均有Cytokeratin 8的高度表达；2)接种于基础培养基的细胞前期以聚集在一起的圆形单克隆细胞团块为主，传至第4代仅有少量细胞存活，细胞随着培养时间增加而状态变差，死亡细胞增多；接种于完全培养基的细胞整体呈“鹅卵石铺路样”成片生长，随着传代次数增加细胞状态稳定，细胞生长曲线呈现“S”形；3)完全培养基培养的第6代乳腺上皮细胞冻存复苏后能快速贴壁并分裂增殖。综上，乳汁分离法成功分离犬乳腺上皮细胞，且与基础培养基相比，完全培养基可以更好地维持细胞活性，促进细胞增殖分裂，且不影响细胞冻存后复苏的活力，为后期快速分离犬乳腺上皮细胞提供较优的培养方案。

【目的】建立奶山羊乳腺上皮细胞体外培养方法,并对原代和传代细胞进行形态观察。【方法】分别采用组织块法和胶原酶消化法培养奶山羊原代乳腺上皮细胞,然后通过胰酶消化法结合反复贴壁法纯化细胞,免疫组化法鉴定细胞,并利用倒置显微镜观察细胞形态。【结果】组织块法和胶原酶消化法均能培养奶山羊原代乳腺上皮细胞;纯化获得的细胞呈卵圆形或多角形,形成典型的鹅卵石或铺路石样,且细胞角蛋白检测呈阳性;多次传代后乳腺上皮细胞出现分化现象,形态多样,增殖仍然旺盛。【结论】成功建立了一种简单易行、经济而实用的奶山羊乳腺上皮细胞体外培养方法。

【目的】探索鸡气管上皮细胞(chicken trachea epithelium,CTE)分离培养技术,并研究传染性支气管炎病毒(infectious bronchitis virus,IBV)在CTE中培养特性。【方法】利用气管灌注冷消化法分离培养CTE,对CTE特异性8/18角蛋白作免疫组化鉴定上皮细胞。培养的CTE分别接种IBVM41株和T株,分别在接种后第12～96小时观察接毒细胞形态学变化,应用电镜技术观察CTE细胞病变和病毒粒子结构,利用RT-PCR技术检测CTE中病毒核酸并对CTE中IBV的血凝性和鸡胚致病性进行检测。【结果】利用灌注冷消化法可以获得形态完整并带有纤毛的CTE,细...