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[期刊] 中国水产科学
[作者]
陈晓艳 何建国
将含有斜带石斑鱼(Epinephelus coioides)神经坏死病毒(orange-spotted grouper nervous necrosis virus,OGNNV)的主衣壳蛋白(main capsid protein,MCP)基因的重组质粒pET32a-MCP转入大肠杆菌BL21后,用异丙基硫代-β-D半乳糖苷(IPTG)诱导表达,用柱层析纯化表达的融合蛋白作为抗原免疫新西兰大白兔,制备抗MCP融合蛋白的血清。用ELISA方法检测抗血清的效价,用Western-blot检测抗血清的特异性。结果显示,获得的抗血清稀释1∶22 000倍时仍呈阳性,并能有效中和OGNNV,实验组的相对...
关键词：
斜带石斑鱼神经坏死病毒 主衣壳蛋白 抗体
[期刊] 水产学报
[作者]
付小哲 李宁求 林强 刘礼辉 吴淑勤
为了建立鳜传染性脾肾坏死病毒（ＩＳＫＮＶ）疫苗抗原含量的ＥＬＩＳＡ检测方法，制备了３株抗ＩＳＫＮＶ主衣壳蛋白（ＭＣＰ）的单克隆抗体，鉴定了其生物学特性。将大肠杆菌表达的重组ＭＣＰ纯化复性后，连续３次免疫ＢＡＬＢ／Ｃ小鼠，然后将免疫小鼠的脾细胞与ＳＰ２／０细胞融合，经过克隆、筛选，获得３株能稳定分泌抗ＩＳＫＮＶ ＭＣＰ蛋白的单克隆抗体阳性细胞株，分别命名为５Ｆ１、３Ｄ９和５Ｂ４，均为Ｉｇ ｇ１亚型。间接ＥＬＩＳＡ实验表明，３株单抗可特异性识别ＩＳＫＮＶ，与鳜弹状病毒、大鲵虹彩病毒等无交叉反应。将５Ｆ１株免疫小鼠后制备腹水，以重组ＭＣＰ和ＩＳＫＮＶ细胞培养物上清液为检测抗原，ＥＬＩＳＡ检测腹水效价．．．
[期刊] 水产学报
[作者]
黄桂菊 陈健光 喻达辉 曾令兵 龙华
利用Invitrogen公司的在线生物学软件分析斜带石斑鱼神经坏死病毒CP基因,设计针对CP基因不同位置的小发卡RNA(short hairpin RNA,shRNA)干扰序列[其结构特征为正链(19 nt)-环(4 nt)-负链(19 nt)]。化学合成这些序列,并退火连接为双链干扰片段,将双链干扰片段定向克隆到干扰载体pENTRTM/U6中,构建shRNA干扰载体pshRNA-124、pshRNA-896和pshRNA-NNV。然后,用脂质体转染法分别将3种shRNA干扰载体和pEGFP-CP基因共转染导入黑头呆鱼(FHM)肌肉细胞,荧光显微镜观察细胞荧光强度,分析荧光抑制效率,Real-...
[期刊] 水产学报
[作者]
陈晓艳 黄剑南 吕玲 翁少萍 何建国
从患病毒性神经坏死病的斜带石斑鱼(Epinepheluscoioids)的头部提取总RNA,根据已发表的神经坏死病毒外壳蛋白基因设计引物进行RT PCR扩增,得到预期大小的基因片段。将此基因片段转入pET载体进行序列测定和分析,结果表明:编码斜带石斑神经坏死病毒(Orange spottedgroupernervousnecrosisvirus,OGNNV)外壳蛋白基因的阅读框核苷酸数为1017bp,编码338个氨基酸;基因的核苷酸序列与野田村病毒科(Nodaviridae)的几种病毒的外壳蛋白基因序列比较结果显示,该病毒与β野田村病毒属(Betanodavirus)中的赤点石斑神经坏死病毒(...
[期刊] 水产学报
[作者]
黄剑南 林蠡 翁少萍 何建国
Viral nervous necrosis (VNN) is a worldwide disease among teleost fish. In the mainland of China, VNN was first identified in 2 species of hatchery-reared groupers, Epinephelus akaara and E. coioides. In the present study, samples were collected from larvae of E. akaara with signs of VNN in Dayawan ...
[期刊] 中国水产科学
[作者]
付小哲 李宁求 彭媛媛 石存斌 白俊杰 吴淑勤
将大肠杆菌重组表达的鳜(Siniperca chuatsi)传染性脾肾坏死病毒(ISKNV)主衣壳蛋白(MCP),以不同剂量(20μg/尾、50μg/尾、100μg/尾)腹腔注射免疫幼鳜(2月龄),测定各免疫组的血清抗体效价变化规律、头肾淋巴细胞增殖刺激指数(SI)、肝脏Mx蛋白表达及相对免疫保护率(RPS)。结果表明,各免疫组抗体效价在第14天时达到峰值,其中50μg/尾免疫组的抗体效价最高,随后各组的效价均下降,至第35天时与对照组无差异;头肾淋巴细胞经LPS、ConA刺激后,50μg/尾免疫组及100μg/尾免疫组的刺激指数均升高,其中50μg/尾免疫组的刺激指数最高,20μg/尾免疫组...
[期刊] 上海海洋大学学报
[作者]
夏立群 张红莲 梁海鹰 刘森林
新加坡石斑鱼虹彩病毒(Singapore grouper iridovirus,SGIV)是导致石斑鱼养殖严重经济损失的主要病原体。本研究构建了含有新加坡石斑鱼虹彩病毒(Singapore grouper iridovirus,SGIV)ORF086基因的重组表达质粒载体pET32a-ORF086,将其转化到大肠杆菌中进行融合表达,经SDS-PAGE分析和Western blot鉴定,证实重组大肠杆菌融合表达了SGIV ORF086蛋白。经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isoprophl-thio-β-D-galactopyranoside,IPTG)浓度、诱导温度、诱导时间等诱导表达条件的优...
[期刊] 渔业科学进展
[作者]
李晋 史成银 王胜强 粟子丹
本研究依据赤点石斑鱼神经坏死病毒(Red-spotted grouper nervous necrosis virus,RGNNV)RNA2的序列,在其3′端设计反转录引物,在5′端设计PCR扩增引物,构建了一种可以评价RNA链相对完整性的RT-PCR方法,命名为LR RT-PCR(Left reverse transcript Right amplify RT-PCR),并对该方法的引物浓度、Mg2+浓度、d NTPs浓度、退火温度4个重要参数进行了优化。结果显示,优化后的LR RT-PCR反应体系为:引物浓度0.2μmol/L、Mg2+浓度4 mmol/L、d NTPs浓度0.5 nmol...
[期刊] 淡水渔业
[作者]
刘立月 刘巍巍 赵丽丽 葛俊伟 唐立杰 刘敏 李一经
利用纯化后的传染性胰腺坏死病毒(IPNV VP3)重组蛋白免疫BALB/c小鼠,通过细胞融合技术,采用间接ELISA和有限稀释法筛选杂交瘤细胞,利用染色体鉴定、蛋白印迹和免疫荧光等方法对单克隆抗体进行鉴定,共得到2株能稳定分泌特异性抗体的阳性细胞株,分别命名为2F1、4A7,亚类鉴定2株单抗均为IgG1亚类。ELISA检测其腹水效价,蛋白印迹检测表明获得的2株单抗均能特异性识别IPNV VP3蛋白;间接免疫荧光鉴定表明2株单抗均与IPNV发生反应;间接ELISA检测结果表明2株单抗均不与HSV、SVCV、HRV等病毒反应,与IPNV具有较强的特异性反应。
[期刊] 水产学报
[作者]
连科迅 赵丽丽 张琳琳 贾鹏 唐立杰 葛俊伟 李一经 刘敏
为制备抗IPNV VP2蛋白的单克隆抗体,对其基本特性进行鉴定并进行初步应用。实验利用Ni-NTA亲和层析纯化的IPNV VP2 COE重组蛋白作为免疫原,免疫8周龄的雌性BALB/c小鼠,经3次免疫后,将免疫小鼠的脾细胞与骨髓瘤SP2/0细胞融合。采用间接ELISA和有限稀释法筛选杂交瘤细胞,共得到2株能稳定分泌特异性抗体的阳性细胞株,分别命名为5G10和5F3,亚类鉴定均为IgG1亚类。2株杂交瘤细胞的染色体数目在75～120之间。间接ELISA检测5G10和5F3细胞培养上清的效价分别为1∶105、1∶102,腹水效价分别为1∶108、1∶104。Western-blotting和间接免...
[期刊] 水产学报
[作者]
罗卫 田飞焱 刘荭 陈焕春 李惠芳 刘宗晓 王侃 蔡伊娜 吕建强
利用RT-PCR技术获得病毒性神经坏死病毒0603株的衣壳蛋白基因,将其插入到杆状病毒Bac-To-Bac表达系统的pFastBacⅠ质粒中,构建了pFastBac-cp质粒。转化DH10Bac大肠杆菌后获得重组穿梭载体Bacmid-cp,脂质体介导将其转染Sf9细胞产生有感染性的重组杆状病毒AcNPV-cp。利用AcNPV-cp感染Sf9细胞后,SDS-PAGE分析可见大小约为37ku的特异性蛋白带,Western-blotting分析发现,其可以与病毒性神经坏死病毒阳性血清反应出现特异性的杂交带。试验结果表明,AcNPV-cp在Sf9细胞中成功地表达了病毒性神经坏死病毒的衣壳蛋白,其具有良...
关键词：
病毒性神经坏死病毒 衣壳蛋白 病毒样颗粒
[期刊] 福建农林大学学报(自然科学版)
[作者]
林楠 吴斌 李苗苗 王巧煌 林国清 樊海平 林克冰
对福建省漳州市某水产养殖场发生的疑似病毒性神经坏死病的病鱼进行病原分离和鉴定.从出现疑似病毒性神经坏死病症状的石斑鱼苗上取眼部、脑部组织进行研磨,将匀浆液接种到条纹月鳢细胞系(SSN)细胞株SSN-1及其克隆细胞株E-11,两株细胞均出现明显的细胞病变,细胞肿胀变圆,呈空泡化并脱落,E-11细胞较SSN-1细胞更早出现细胞病变,且病变更明显.将病鱼眼部、脑部组织的研磨液、细胞培养上清进行RT-PCR检测,均检测出病毒性神经坏死病病毒(VNNV)的特异性条带,目的片段大小为427 bp,序列比对结果提示该病原为赤点石斑鱼神经坏死病毒(RGNNV).电镜观察结果显示,细胞培养上清中存在直径约30 nm的病毒颗粒,细胞质内大量病毒颗粒聚集成团,细胞器受损,细胞结构被破坏.将分离得到的VNNV进行温度、酸碱度敏感性试验,结果显示:50℃下处理30 min后该病毒滴度明显下降,60℃处理30 min后病毒失活;在pH为3、11的条件下病毒滴度均明显下降.
关键词：
石斑鱼 病毒性神经坏死病 分离 鉴定
[期刊] 淡水渔业
[作者]
赵永欣 赵丽丽 刘巍巍 王建楠 李一经 乔薪瑗 葛俊伟 刘敏
应用RT-PCR方法扩增了长度为1176 bp的IHNV-ZYX株编码核衣壳(N)蛋白基因,将N基因克隆至原核表达载体pET30b,并在大肠杆菌Rosetta(DE3)中得到了表达。通过SDS-PAGE分析表明,重组菌诱导后得到了预期大小约48 KD的N蛋白,与理论值相符;提取N蛋白的包涵体,并制备抗血清。间接ELISA和Western-blot-ting实验结果说明,表达的N蛋白与天然的IHNV N蛋白一样具有相同的抗原性。本试验结果为进一步研究分离株IHNV-ZYX N基因的免疫功能,建立灵敏高效的检测传染性造血组织坏死病的方法和研制基因工程疫苗奠定了重要的物质基础。
[期刊] 渔业科学进展
[作者]
朱旭 兰文升 刘荭 高隆英 杜鹃 陈孝煊
应用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)从传染性造血器官坏死病毒(Infectious hemato-poietic necrosis virus,IHNV)感染的细胞悬液克隆病毒的糖蛋白基因,将其亚克隆至原核表达载体pCWori,转化到大肠杆菌DH5α,通过发酵大肠杆菌制备病毒糖蛋白。经SDS-PAGE分析,诱导表达的重组蛋白主要以包涵体的形式存在,使用Ni-NTA亲和层析柱在变性条件下进行纯化并透析复性,最终得到了较高纯度的可溶性糖蛋白,分子量约为57kDa。Western-blot分析结果显示,所表达的蛋白能够被IHNV病毒制备的兔抗IHNV血清识别。用复性后的蛋白免疫小鼠制备抗血清,E...
[期刊] 中国水产科学
[作者]
陈信忠 苏亚玲 龚艳清 黄丽莎 俞秀霞 苏永全
神经坏死病毒(Nervousnecrosisvirus)是导致多种海水鱼类神经性病害的致病原。发病及死亡的石斑鱼除了表现神经异常症状外,无明显的临床病症,体表及内脏组织也未发现明显病变及寄生虫感染。2003年4～8月,应用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)技术从福建南部人工养殖的5种石斑鱼即紫石斑鱼(Epinepheluslanceolatus)、马拉巴石斑鱼(E.malabaricus)、青石斑鱼(E.awoara)、赤点石斑鱼(E.akaara)和云纹石斑鱼(E.moara)中检出5个神经坏死病毒分离株。检测了76份石斑鱼样品,这些石斑鱼NNV病毒的平均感染率约为90%。对这些病毒的RT...
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