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[期刊] 水产学报
[作者]
殷志新 翁少萍 叶巧真 何建国
用Tripure试剂盒提取斜带石斑白细胞总RNA ,反转录合成第一链cDNA ,进行长距离PCR ,蛋白酶K消化 ,SfiI酶切 ,通过CHROMASPIN - 4 0 0柱 ,回收大于 5 0 0bp的cDNA ,与λTripIEx2载体连接 ,体外包装后构建了斜带石斑白细胞的cDNA文库。库容 1.6 5× 10 6,重组频率 82 % ,扩增后滴度 7.5× 10 9pfu·mL-1。插入片断长度 5 0 0～ 2 30 0bp ,最多的是在 75 0～ 10 0 0bp范围。本文库可作为筛选斜带石斑细胞因子基因的重要资源
[期刊] 西南农业学报
[作者]
李超 陈明 李莉萍 黄维义 余晓丽 黄婷 张彬 雷爱莹 陈福艳 梁万文
为筛选罗非鱼链球菌疫苗免疫前后白细胞表达变化基因及探讨鱼类白细胞免疫机理,利用抑制性差减杂交(SSH)技术,以链球菌疫苗免疫前后罗非鱼白细胞cDNA为材料,构建了罗非鱼免疫前后正、负2个cDNA差减文库,并采用地高辛(DIG)标记差减文库cDNA作为探针,进行差异表达片段的筛选鉴定。结果显示:2个文库重组率均在90%以上,插入片段在300～900 bp,接头连接效率超过50%,差减效率非常高效,阳性率均超过70%。杂交筛选后正、负文库各挑选30个阳性克隆进行测序组装聚类,正、负文库各获得16和18条非冗余EST(unigene),所得序列经GenBank同源性分析,正、负文库各有10和11条u...
[期刊] 水产学报
[作者]
卢强 丰培金 李莲瑞 付宝权 刘明远
Leukocytes are key cells for the specific and nonspecific immune systems, it expresses different kinds of biodefense-related peptides and proteins including specific and nonspecific antimicrobial agents, and activators and regulators of the immune system. However,we know very little about the cellul...
关键词：
鲤 外周血白细胞 cDNA文库
[期刊] 西南农业学报
[作者]
陈明 李超 王瑞 李莉萍 甘西 余晓丽 雷爱莹 黄婷 陈福艳 梁万文
为大规模快速克隆罗非鱼细胞免疫功能基因,采用SMART技术,构建了尼罗罗非鱼链球菌疫苗免疫后外周血白细胞全长cDNA文库。提取免疫后第3、5和7天外周血白细胞总RNA,用PowerscripTM反转录酶逆转录合成第一链cDNA,LD-PCR扩增获得双链cDNA,经SfiI酶切和CHROMASPIN-400TM柱分级分离,收集500 bp以上的片段重组于改造的pBluescript II SK载体并转化大肠杆菌DH5α,测定文库滴度、重组率及库容量。结果表明,构建的cDNA文库原始库容量1.021×106克隆,文库滴度1.078×106pfu/mL,重组率94.71%,插入片段大小0.75~3....
[期刊] 水产学报
[作者]
骆源 张春晓 王玲 张冬玲 霍振华 宋凯
本研究以斜带石斑鱼肝细胞为实验对象，在不同培养条件下进行原代培养，旨在探讨稳定可靠的斜带石斑鱼肝细胞分离及原代培养方法。采用组织块分离法和胰蛋白酶（含ＥＤＴＡ）消化法分离肝细胞，并通过密度梯度离心法分离纯化肝细胞，细胞悬液于ＤＭＥＭ／Ｆ－１２、Ｍ１９９和Ｌ－１５培养液中培养；细胞活力及数量采用血球计数板计数，并通过ＭＴＴ法测定细胞增殖率；同时，测定不同时间培养上清液中乳酸脱氢酶（ＬＤＨ）活性、白蛋白（ＡＬＢ）和尿素氮（ＢＵＮ）的含量，以分析肝细胞生长状态。结果表明，组织块方法不适于斜带石斑鱼肝细胞的培养，未见细胞从组织块中迁出，而胰蛋白酶消化法获得良好稳定的培养效果，细胞产量达到１．６×１０８．．．
[期刊] 海洋水产研究
[作者]
王维新 史成银 黄倢
利用SMART (SwitchingMechanismat 5’endofRNATranscript)技术 ,以同源重组的方式构建了中国明对虾鳃细胞的全长cDNA文库。首先用RNA提取试剂盒从中国明对虾鳃细胞中提取总RNA ,以总RNA为模板 ,CDSⅢOligo(dT)为引物 ,反应一段时间后 ,再加入转换模板 (Switchingtemplate) ,反转录合成cDNA第 1链。在DNA聚合酶的作用下 ,通过长距离PCR ,扩增双链DNA。双链cDNA经凝胶过滤柱纯化后 ,与线性化的 pGADT7 Rec质粒载体同源重组 ,转化感受态AH10 9酵母菌株后 ,得到中国明对虾鳃细胞的全长cD...
[期刊] 福建农林大学学报(自然科学版)
[作者]
杨倩 包涛涛 鲜思美 张友 梁倩 顾庆林
为筛选与羊口疮病毒(OrfV)蛋白相互作用的宿主细胞蛋白，构建了羔羊睾丸(LT)细胞酵母双杂交cDNA文库.采用Trizol法提取LT细胞总RNA,运用SMART技术经LD-PCR合成全长cDNA,再经同源重组法将pGADT7-Rec载体与cDNA共转化至Y187酵母菌株，利用营养缺陷型选择性培养基(SD/-Leu)筛选阳性克隆，并鉴定文库质量.结果显示：LT细胞酵母双杂交cDNA文库构建成功，其文库滴度为2.33×10~8 CFU·mL~(-1),文库容量达3.5×10~9 CFU;随机挑选34个单克隆进行PCR检测，插入片段大小为250～2 000 bp,平均大小约为1 000 bp,文库重组率达100%.由此表明，本文库达到高质量文库条件，可作为研究OrfV与宿主细胞间互作机制的生物材料.
[期刊] 中国水产科学
[作者]
段亚飞 刘萍 李吉涛 李健 陈萍
采用SMART技术(Switching Mechanism At 5′end of RNA Transcript)构建了脊尾白虾(Exopalaemon carini-cauda)血细胞全长cDNA文库。结果表明:cDNA初级文库滴度为2.8×106pfu/mL,重组率达99%以上,插入片段在400~2 000 bp;扩增文库滴度为4.3×109pfu/mL。随机挑取100个单克隆进行测序,得到95条平均长度为493 bp的高质量EST序列,序列拼接获得70条unigenes,包括11条contigs和59条singlets。Blast同源比对发现,其中20条unigenes与数据库中已知基因...
[期刊] 海洋渔业
[作者]
申望 叶茂 石戈 王日昕
三疣梭子蟹是我国沿海重要养殖品种之一,近年来养殖病害呈逐年上升趋势,制约了三疣梭子蟹养殖产业的健康可持续发展。为大规模克隆三疣梭子蟹免疫相关基因,研究其免疫基因的功能和免疫机制,奠定三疣梭子蟹病害防治理论基础,采用SMART技术构建了三疣梭子蟹血细胞全长cDNA文库。经测定,文库滴度为1.14×107pfu/mL,文库总容量为5.7×107pfu,重组率达到98%,插入片段平均长度为817.5 bp。文库随机测序获得的70个全长cDNA,从中发现18个已知基因和5个未知基因。已知基因主要为多肽/蛋白质合成相关基因,共9个;免疫相关基因4个,分别是抗菌肽hyastatin、C-reactive ...
[期刊] 中国水产科学
[作者]
李吉涛 李健 陈萍 刘萍 何玉英 王清印
采用SMART(Switching mechanism at5′end of RNA transcript)技术构建了中国明对虾(Fenneropenaeus chinensis)血细胞和肌肉组织全长cDNA文库。以中国明对虾"黄海1号"血细胞和肌肉组织为材料,Trizol法提取总RNA,磁珠法纯化mRNA后,用SMART cDNA合成试剂盒合成双链cDNA。双链cDNA经SfiⅠ酶切和CHROMA SPINTM-400过柱分级分离后,与λTriplEx2载体两臂进行连接,随后进行λ噬菌体体外包装反应,构建血细胞和肌肉全长cDNA文库。肌肉组织原始文库滴度为0.77×106pfu/mL,血细胞...
关键词：
中国明对虾 血细胞 肌肉 cDNA文库
[期刊] 中国农业科学
[作者]
罗维玉 朱鹏阳 张杰 胡永浩 孔晖晖 梁立滨 周圆 李呈军 姜丽 陈化兰
【目的】构建肺组织细胞Ｃａｌｕ－３及ａ５４９的高质量酵母ＣＤＮａ文库并筛选与流感病毒ＮＰ蛋白相互作用的宿主因子，为深入研究流感病毒ＮＰ蛋白功能、病毒复制及致病机制奠定基础。【方法】提取等量Ｃａｌｕ－３及ａ５４９细胞的总ＲＮａ，混合后反转录生成ＣＤＮａ，利用长距离ＰＣＲ（ｌＤ－ＰＣＲ）扩增合成ＤｓＣＤＮａ，用ＣＨＲＯＭａ ｓＰＩＮＴＭ＋ＴＥ－４００纯化柱纯化ＤｓＤＮａ，按照ＣｌＯＮＴＥＣＨ公司的ＭａｋＥ ＹＯｕＲ ＯｗＮ＂ＭａＴＥ＆ＰｌａＴＥ＂ｌＩｂＲａＲＹ ｓＹｓＴＥＭ操作程序，将带有同源臂的ＤｓＣＤＮａ与线性化Ｐ ＧａＤＴ７－ＲＥＣ共同转化Ｙ１８７酵母感受态细胞，涂布ｓＤ／－ｌＥｕ平板后于３．．．
[期刊] 淡水渔业
[作者]
许晨 周勇 史玉恒 范玉顶 刘文枝 江南 赵建青 曾令兵
为深入研究鲤疱疹病毒Ⅱ型CyHV-2与宿主细胞相互作用机制,以鲫脑组织细胞系(Gibel carp brain,GiCB)总RNA为模板,反转录合成cDNA,扩增获得双链cDNA,与载体pGADT7-Rec共转化酵母菌Y187,构建了GiCB细胞酵母双杂交cDNA文库。以CyHV-2 ORF25编码蛋白为诱饵,与GiCB细胞酵母双杂交cDNA文库杂交,筛选与其互作的GiCB细胞受体。结果显示:GiCB细胞酵母双杂交cDNA文库转化效率为1.03×10~6 CFU/μg,滴度为1.24×10~6 CFU/mL,PCR扩增结果表明文库中插入片段的大小在1.5 kb左右。将表达CyHV-2 ORF25编码蛋白的诱饵菌与GiCB细胞酵母双杂交cDNA文库杂交后,筛选得到与ORF25编码蛋白相互作用蛋白的阳性克隆,为进一步研究CyHV-2的感染机制奠定了前期基础。
[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
赵梅勤 李玉蓉 邹丽芳 陈功友
提取经条斑病菌(Xanthom onas oryzae pv. oryzicola)侵染诱导后的水稻mRNA,利用SMARTTM技术于载体pGADT7-SfiAB上构建了水稻cDNA文库。检测发现,文库中含有水稻病程相关蛋白基因O sPR-1 a、O sPR-1 b和PAL。随机提取cDNA文库克隆的质粒,酶切分析发现,该cDNA文库的插入片段分布在500~2 000 bp之间,平均大小约为1 kb,重组率达95%。上述结果表明,水稻受条斑病菌侵染的cDNA文库质量较好,这为研究条斑病菌致病性因子与水稻互作机制奠定了工作基础。
[期刊] 中国水产科学
[作者]
刘志刚 翁幼竹 宋海霞 方永强
应用免疫细胞化学SABC方法,用5-羟色胺(5-Hydroxytryptamine,5-HT)、生长抑素(Somatostatin,Som)、P物质(Substance P,SP)、胃泌素(Gastrin,GAS)和神经肽Y(Neuropeptide,NPY)5种特异性哺乳类胃肠激素抗血清对斜带石斑鱼(Epinepheluscoioides)稚鱼期的消化道进行免疫细胞化学定位。结果显示,5-HT-和Som-样免疫活性细胞定位在斜带石斑鱼稚鱼的胃各部,包括胃贲门部、胃体和胃幽门部;SP-、GAS-样免疫活性细胞则在胃和肠均存在,其中SP-样细胞定位在胃体部和胃幽门部以及整个肠道,GAS-样细胞则...
[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
李祥瑞 金红 卢景良
用哺乳动物细胞表达克隆系统克隆了鸡ＩＬ－２ｃＤＮＡ。以ＣｏｎＡ（２０μｇ／ｍＬ）诱导ＳＰＦ鸡脾脏淋巴细胞，第２０小时收集细胞，提取ｍＲＮＡ，以ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＰｌａｓｍｉｄＳｙｓｔｅｍｆｏｒｃＤＮＡＳｙｎｔｈｅｓｉｓ试剂盒合成ｃＤＮＡ，定向连结于穿梭质粒ｐＳＶ·ＳｐｏｒｔⅠ，构建ｃＤＮＡ文库。将文库分组提取重组质粒，转染ＣＯＳ－７细胞，表达ｃＤＮＡｓ。以淋巴细胞增殖试验检测表达产物ＩＬ－２活性。经过３轮筛选，获得１４个具有ＩＬ－２活性的克隆。选择其中４个进行酶切分析，结果显示这４个ｃＤＮＡ大小分别为１．５，１．０，０．８和０．８ｋｂ。
关键词：
鸡 白细胞介素-2 cDNA 克隆
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