【目的】对斜卧青霉转录调控因子Hac1进行染色质免疫共沉淀(CHIP)试验,为其调控机制及生物学功能研究奠定基础。【方法】以斜卧青霉为材料,DTT诱导转录调控因子Hac1表达,用交联Buffer处理菌丝,使Hac1与靶基因交联,超声破碎染色质后,进行解交联染色体检验,研究不同交联时间(5,10,20,30,40min)、不同菌丝用量(10mL CHIP缓冲液中分别添加0.25,0.50,1.00,1.50g菌丝)及不同超声功率(15,20,25,30 W)、超声时间(1,3,5s)、超声间隔时间(10,2

为研究羊种布鲁氏菌转录调控因子ＭｕｃＲ蛋白的毒力相关机制，对染色质免疫共沉淀技术进行了优化。构建了表达ＭｕｃＲＦｌａｇ融合蛋白的羊种布鲁氏菌菌株，并用商品化抗Ｆｌａｇ标签抗体对ＭｕｃＲＦｌａｇ蛋白进行富集，从而替代ＭｕｃＲ蛋白抗体的制备过程。通过该染色质免疫共沉淀方法对羊种布鲁氏菌ＭｕｃＲ蛋白的结合靶点基因进行了鉴定，结果显示：通过使用该方法鉴定出羊种布鲁氏菌ＭｕｃＲ蛋白可以结合到ＢＭＥＩ０４３０和ＢＭＥＩ１３６４（ＭｕｃＲ基因）的启动子序列上。结果表明优化的染色质免疫共沉淀技术适用布鲁氏菌转录调控因子结合靶点的研究。

【目的】以增强型绿色荧光蛋白为报告基因，构建斜卧青霉转录调控蛋白Ｈａｃ１激活形式基因（Ｈａｃ１ｉ）随机插入过表达菌株和非激活形式基因（Ｈａｃ１ｕ）原位插入过表达菌株，并初步观察Ｈａｃ１基因的２种不同编码蛋白在菌丝内部的运动情况，为进一步研究转录调控蛋白Ｈａｃ１的功能奠定基础。【方法】分别克隆ｐｔｒａ筛选标记、ｇｐｄａ启动子、Ｈａｃ１ｉ编码区、ｅｇＦｐ编码区及终止子，利用融合ｐｃｒ融合克隆片段，构建Ｈａｃ１ｉ随机插入表达盒；再分别克隆Ｈａｃ１上游臂及编码区、ｅｇＦｐ编码区及终止子、ｐｔｒａ筛选标记、Ｈａｃ１下游臂序列，融合克隆片段，构建Ｈａｃ１ｕ原位插入表达盒。将２种表达盒分别转化斜卧青霉原生质．．．

以拟南芥成熟叶片为材料,探索3种不同型号超声破碎仪器的染色质免疫共沉淀(Ch IP)超声破碎条件.根据超声破碎结果推荐使用Covaris M220 Focused-ultrasonicator仪器,并将该仪器破碎条件设置为10%duty cycle、75 Watts Intensity Peak Incident power、200 cycle per Burst、7℃bath temperature、破碎时间12 min时,可获得约500 bp的DNA片段.同时,为检测不同H3K9ac抗体用量对染色质免疫沉淀效率的影响,通过半定量和实时荧光定量PCR检测确定初始量0.25 g的拟南芥叶片所需H3K9ac抗体的最适用量为3μL.此外,以不同衰老程度的水稻旗叶为材料,根据上述破碎条件,进一步优化超声破碎时间,同样可以获得合适的DNA片段,根据优化的样品与抗体用量比例,通过免疫沉淀可以获得适用于后期实时定量PCR(Ch IP-q PCR)和高通量测序(Ch IP-seq)分析的DNA样品.

真核生物转录调控过程是大量的顺式调控元件与反式作用因子相互作用的结果.研究发现,这一调控过程与染色质核小体的动态定位相关,调控因子的结合需要裸露的无核小体的DNA区域,即开放的染色质位点.因此,高效精确地定位基因组上的开放染色质位点为成功地发掘基因组调控元件,乃至揭示基因表达调控机制提供了重要线索和有效手段.本文对开放染色质位点的定义、主要研究方法以及功能注释进行概述,希望对在基因组水平上调控元件的发掘,尤其是在植物中的应用提供借鉴.

蛋白质组学研究的瓶颈问题之一是低丰度蛋白的检测,这些低丰度蛋白往往发挥多种重要的生理功能,如细胞防御、基因表达调节、信号传导等,因此低丰度蛋白的检测尤为重要。在双向电泳试验时,有2个因素限制了低丰度蛋白的检测:第一,IPG胶条的上样量有限;第二,高丰度蛋白的位置效应(王旭,2007)。例如,植物叶片中高丰度蛋白Rubisco含量超过50%(Gutteridge et al.,1995),这些高丰度蛋白的存在影响低丰度蛋白的分析。应用PEG分级提取法对水稻(Oryza sativa)叶片蛋白提取发现,

【背景】随着规模化、集约化生产程度的不断提高，养殖过程中饲养空间受限、冷热环境不适等因素常使猪处于应激状态。内质网应激（endoplasmic reticulum stress, ERS）可能是最早期的应激反应，与细胞凋亡、代谢等方面有密切联系。肝脏是机体的主要代谢器官，猪养殖过程中由于人工操作（如断奶）、饲料霉变、温度变化和吸入有害气体等因素都会造成猪肝脏的ERS，不仅会造成肝脏损伤，还会引发肝脏的脂肪代谢紊乱和广泛的炎症反应，影响生产性能和繁殖性能。因此，深入探讨缓解ERS的有效措施，有助于减少猪养殖过程中的隐性损失。【目的】利用免疫沉淀联合质谱技术，从猪肝星状细胞中筛选在ERS条件下与葡萄糖调节蛋白94(GRP94)相互作用的细胞蛋白，为进一步探讨GRP94对猪肝星状细胞生物学功能的保护作用机理奠定基础。【方法】首先将GRP94抗体固定在谷胱甘肽亲和磁珠上，用亲和磁珠与ERS条件下或正常条件下猪肝星状细胞总蛋白进行孵育，与GRP94诱饵蛋白结合的蛋白复合物洗脱收集后，进行SDS-PAGE凝胶电泳验证。将验证成功的样品洗脱液进行液相色谱串联质谱（LC-MS/MS）检测，鉴定出正常条件和ERS条件下GRP94的互作蛋白。运用生物信息学在线软件对筛选的互作细胞蛋白进行GO富集、KEGG信号通路注释和蛋白互作网络分析，并对其中的互作蛋白之一波形蛋白（vimentin）进行免疫共沉淀验证。【结果】筛选到正常条件下与GRP94存在互作关系的蛋白146个，ERS条件下与GRP94存在互作关系的蛋白76个，在两种情况下都存在互作关系的蛋白44个。ERS条件下有互作关系的76个蛋白质主要参与凋亡过程负调控、肽段交联、泛素依赖型ERAD(endoplasmic reticulum associated degradation)过程和过氧化氢分解代谢等过程。其中参与凋亡过程负调控的GRP94互作蛋白有albumin、catalase、filament A、heat shock protein family A member 5、keratin 18和prohibin 2，说明GRP94可能与这些蛋白共同发挥抗凋亡作用。除此之外组成中间丝纤维的vimentin蛋白参与多个GO富集的通路，可能与GRP94有重要的互作关系。进一步的免疫共沉淀试验也证实，ERS条件下vimentin和GRP94之间确实存在互作关系。此外，某些ERS条件下特异性表达的GRP94互作蛋白（如peroxiredoxin、death inducer obliterator 1、catalase、glandular kallikrein、pyruvate kinase等）与抗凋亡有密切联系。【结论】ERS条件下，猪肝脏GRP94互作蛋白主要参与抗凋亡、对未折叠蛋白进行折叠和维护细胞内稳态相关的信号通路。该结论为下一步开展GRP94参与肝脏ERS调控机制的研究打下基础。

【目的】探究白粉病胁迫对青稞基因表达和染色质开放性的影响及青稞白粉病胁迫响应分子机制。【方法】对青稞白粉病高抗品种GND7和高感品种ZQ13进行白粉菌侵染和空白处理（利用水替代侵染），收集青稞叶片进行转录组测序和染色质开放性测序，筛选差异表达与差异开放性基因。【结果】ZQ13样本白粉菌侵染前后得到1647个差异基因，其中980个基因在侵染过程中上调表达，667个基因在侵染过程中下调表达。针对白粉菌侵染过程中染色质开放性研究发现，ZQ13样本侵染前后共获得7310个差异开放性区域，其中424个区域开放性上调，6886个区域开放性下调。GND7样本白粉菌侵染前后得到1119个差异基因，其中657个基因在侵染过程中上调表达，462个基因在侵染过程中下调表达。针对白粉菌侵染过程中染色质开放性研究发现，GND7侵染前后共获得2573个差异开放性区域，其中1343个区域开放性上调，1230个区域开放性上调。通过转录组和染色质开放性联合分析，筛选出AP2/ERF转录因子（HOVUSG2735700）、MYB1R1转录因子（HOVUSG4226000）等。【结论】青稞在白粉菌侵染过程中基因表达量与染色质开放性发生了较大变化，AP2/ERF转录因子（HOVUSG2735700）、MYB1R1转录因子（HOVUSG4226000）等可能在青稞响应白粉病胁迫中发挥了重要作用。

【目的】Dickkopf样顶体蛋白1(DKKL1)是一种重要的顶体蛋白，为发掘其重要功能及潜在的临床价值，以版纳微型猪近交系(BMI)为对象，研究其睾丸组织中DKKL1的分子结构、转录调控特征和蛋白质功能。【方法】通过全转录组测序获得BMI DKKL1的表达量，使用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)获得DKKL1编码区序列并分析其基因结构和蛋白质特征，使用UniProt数据库对DKKL1进行功能注释并分析DKKL1与微小RNA(miRNA)、长链非编码RNA(lncRNA)间的竞争性内源RNA(ceRNA)转录调控。【结果】获得的BMI DKKL1编码区全长为702 bp,位于基因第6号染色体上，有5个外显子和4个内含子；蛋白质功能分析表明，DKKL1包含233个氨基酸，具有疏水性，含磷酸化位点、信号肽和较多的无规则卷曲亚结构；系统进化和同源性分析表明，DKKL1氨基酸序列在哺乳动物间高度保守；蛋白互作分析显示，DKKL1与含螺旋结构域的蛋白155(CCDC155)、转录增强缔合域蛋白2(TEAD2)、RAS癌基因家族成员11B(RAB11B)等多种蛋白互作；基因本体(GO)和京都基因与基因组百科全书(KEGG)富集分析表明，这些蛋白富集在典型Wnt信号等通路上；GO功能注释表明，DKKL1在睾酮生物合成过程的负向调控、透明带穿透、顶体泡生成等方面具有重要功能；ceRNA转录调控网络分析表明，DKKL1被miR-15a和miR-15b靶向调控。【结论】本研究获得了BMI睾丸全转录数据，阐明了DKKL1的分子特征、蛋白质功能并构建了转录调控网络。

[目的]本文旨在鉴定重要农业害虫斜纹夜蛾(Spodoptera litura)气味结合蛋白基因GOBP2的顺式作用元件,为揭示GOBP2的转录调控机制和开发基于嗅觉干扰的害虫防治技术奠定基础。[方法]利用5′RACE技术克隆GOBP2的5′UTR,确定转录起始位点;利用染色体步移技术(chromosome walking)克隆GOBP2的5′侧翼区,并利用在线网站预测转录因子结合位点;利用PCR克隆GOBP2的5′侧翼区逐步缺失片段,并构建到pGL3-Basic载体上;将各重组载体分别转染Sf9细胞,48 h后收获细胞并利用双荧光素酶报告系统检测转录活性。[结果]获得斜纹夜蛾GOBP2长23 bp的5′UTR,由此确定GOBP2的转录起始位点。通过染色体步移获得斜纹夜蛾GOBP2的5′端调控区2 025 bp的序列,发现启动子的典型TATA框;针对-1 000 bp序列的转录活性分析表明,最强转录活性区域位于-243～-207 bp,具有1个增强子;此外,在-971～-891 bp及-890～-811 bp各有1个增强子,在-244～-315 bp存在1个沉默子。[结论]获得斜纹夜蛾GOBP2的转录起始位点及顺式作用元件,为进一步研究GOBP2的转录调控机制奠定了基础。

为了研究HKT1在普通小麦及其野生近缘种中的自然多样性,揭示HKT1结构与功能的关系,采用克隆测序的方法对38份普通小麦和13份小麦野生近缘种HKT1基因组序列进行了分析。在38份普通小麦材料中共发现5种HKT1序列,分别命名为HKT1-1~HKT1-5,其中29份材料仅含有1种类型HKT1。而在13份小麦野生近缘种中发现19种HKT1,其中根据HKT1基因组序列预测13种有完整读码框。普通六倍体小麦的核苷酸多样性仅相当于其野生近缘种的23.8%。这些结果表明,HKT1在小麦基因组中属于多拷贝基因,HKT1在栽培驯化过程中受到了选择,属于驯化基因。利用中国春小麦缺四体和W7984×Opata8...

两性生殖中，精子作为携带父本信息的载体，是物种延续的关键因素。精子发生经历精原细胞、初级和次级精母细胞、圆形精子、成熟精子阶段。在圆形精子形成成熟精子过程中，染色质进行重塑，细胞形态发生剧烈变化，其中，组蛋白修饰和组蛋白变体在这些过程中发挥了重要作用：如甲基化主要与基因表达的激活或抑制有关；乙酰化激活转录活性并参与组蛋白沉积和DNA修复；磷酸化促进转录后修饰或参与DNA双链断裂修复；泛素化调节不同细胞途径中各式各样的蛋白质底物。组蛋白变体在调节染色体结构中发挥重要功能：如组蛋白H1变体在分化过程中具有抑制转录的作用；组蛋白H2A和H2B变体在精子染色质包装过程中发挥特有功能；H3.3是H3最重要的变体，在细胞周期的各个时期都表达；组蛋白H4则是进化最慢的组蛋白之一，目前还没有发现其组蛋白变体。本文围绕组蛋白翻译后修饰，梳理了甲基化、乙酰化、磷酸化、泛素化等方面的最新进展和组蛋白变体在染色质重塑过程中的功能研究进展，随后针对各类组蛋白变体及其功能进行了总结，最后以半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)为例简要介绍这些研究对水生动物精子发生的启示。

用ＳＤＳ－ＰＡＧＥ法鉴定了３２个小麦品系的高分子量麦谷蛋白亚基组成，分析了其与ＳＤＳ沉降值及面粉蛋白质含量的关系。结果表明，亚基对ＳＤＳ沉降值的影响较大，其中，Ｇ１ｕ－Ｂ１控制的亚基７十８优于７，Ｇｌｕ－Ａ１控制的亚基１或２优于Ｎｕｌｌ，亚基数目多的优于亚基数目少的。亚基与蛋白质含量间无明显联系。

以嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)J-1株基因组为模板,根据GenBank已发表的嗜水气单胞菌外膜蛋白的基因序列设计1对引物,扩增去除信号肽序列的成熟外膜蛋白OmpA的基因片段,定向克隆至表达质粒pET32a(+)中,重组质粒经限制性酶切鉴定后测序。结果表明,插入片段长度为948bp,与NCBI上登录的几个相关序列相比,同源性在93.1%~95%之间,缺失4个氨基酸。将重组原核表达质粒pET32a-OmpA转化至大肠杆菌BL21(DE3),经诱导可表达分子量约57.4kD的蛋白,凝胶薄层扫描显示OmpA在转化菌中表达量占全菌蛋白的50%以上。用兔抗J-1株总外膜蛋白血清...

IGFN1基因可在骨骼肌中特异性表达,并呈现出免疫球蛋白Ⅰ和纤维连接蛋白Ⅲ组合的肌小节蛋白的结构域特征。其作用主要是参与蛋白翻译、肌细胞分化、骨骼肌收缩和细胞骨架稳定等。本研究主要对IGFN1基因的结构特点、在动物体内的基因表达调控、参与的信号转导途径,以及动物氧化应激反应与IGFN1表达之间的关系等方面的相关研究进展进行综述,以期为骨骼肌纤维类型转换相关机制的研究提供资料,也为氧化应激条件下修复肌肉损伤及改善猪肉品质的深入研究提供新思路。