【目的】克隆斑翅果蝇(Drosophila suzukii)气味结合蛋白56h(odorant binding protein 56h,OBP56h)基因,诱导表达斑翅果蝇OBP56h重组蛋白(DsuzOBP56h),研究其与小分子化合物的结合特性。【方法】通过RT-PCR并设计特异性引物克隆斑翅果蝇OBP56h ORF全长,从NCBI数据库中下载相似度高的昆虫气味结合蛋白序列,进行序列比对和分析。以NdeⅠ和XhoⅠ为酶切位点,将OBP56h连入pET-30a(+)原核表达载体,将重组质粒转入BL21(DE3)大肠杆菌感受态细胞。扩大培养阳性菌株,并用IPTG诱导表达DsuzOBP56h重组蛋白。收集菌液,通过超声波破碎细胞得到蛋白,利用Ni-NTA柱纯化蛋白,进行Tris-HCl透析,用BCA法测定蛋白浓度。蛋白用50 mmol·L~(-1) Tris-HCl(pH 7.4)稀释至终浓度2μmol·L~(-1),配基用色谱级甲醇稀释至终浓度1 mmol·L~(-1),以4,4′-二苯胺基-1,1′-联萘-5,5′-二磺酸二钾盐(4,4′-dianilino-1,1′-binaphthyl-5,5′-disulfonicacid dipotassium salt,bis-ANS)荧光探针为报告子,利用荧光竞争结合试验检测DsuzOBP56h蛋白与18种候选小分子化合物配基的结合特性。【结果】克隆获得了斑翅果蝇OBP56h的ORF全长,共405 bp,N-端含有19个氨基酸组成的信号肽,具有6个保守半胱氨酸位点,符合OBP的典型特征,与其同属的黑腹果蝇OBP56h进化关系最近。成功连入pET-30a(+)表达载体,在1 mmol·L~(-1) IPTG、28℃条件下诱导DsuzOBP56h蛋白表达,并过柱纯化得到目的蛋白。荧光光谱试验显示,荧光探针bis-ANS与DsuzOBP56h的解离常数为0.9568μmol·L~(-1),适合作为本试验中竞争性荧光结合试验的报告子;进一步的荧光竞争结合试验表明,在18种候选配基中,苦味物质盐酸小蘖碱和香豆素与DsuzOBP56h的结合亲和性较强,解离常数分别为12.16和17.93μmol·L~(-1),柚皮素与DsuzOBP56h的解离常数为25.32μmol·L~(-1),草莓叶片产生的一种对斑翅果蝇具有吸引作用的挥发性气味物质β-环柠檬醛也能与DsuzOBP56h结合,其解离常数为31.37μmol·L~(-1)。【结论】斑翅果蝇气味结合蛋白OBP56h能与测试的多种植物苦味物质和挥发性气味物质结合,表明DsuzOBP56h很有可能参与斑翅果蝇对食物味觉和嗅觉的识别行为,研究结果可为理解斑翅果蝇的取食行为提供理论依据,并为开展斑翅果蝇的生态防控提供新思路。

【目的】克隆与鉴定美洲斑潜蝇(Liriomyza sativae)气味结合蛋白(odorant binding protein,OBP)基因,并对其序列特征、表达情况、系统发育及蛋白功能进行研究,为深入研究美洲斑潜蝇嗅觉机制提供依据。【方法】通过PCR技术克隆美洲斑潜蝇OBP13编码区全长,用DNAMAN对其进行序列分析,用BLAST进行同源性比较,并使用MEGA6.0构建进化树,进行系统发育分析。通过实时定量PCR对OBP13在美洲斑潜蝇不同组织中的表达情况进行分析。构建原核表达载体,进行原核表达及蛋白

【目的】克隆南瓜实蝇(Bactrocera tau)的气味结合蛋白(odorent binding proteins, OBPs)基因,并分析其相关生物学信息,为了解南瓜实蝇的嗅觉机制提供参考。【方法】基于南瓜实蝇转录组测序结果筛选获得OBPs基因并进行生物信息学分析,通过基因克隆测序验证鉴定OBPs基因,并采用sqRT-PCR检测OBPs在雌、雄虫不同组织中的分布情况。【结果】经PCR产物测序验证和BLAST比对后共鉴定得到6个南瓜实蝇OBPs基因,序列长度在498～955 bp,编码128～314 aa,预测分子量大小为14.67～36.24 kDa,等电点为4.69～8.16,且每个OBP序列的N端均具有16～26 aa组成的信号肽序列,属于1个Minus型和5个Classic型。不同类型的OBPs均具有各自典型保守的Cys位点。6个OBPs分化明显,序列相似度在30%～51%。系统进化树表明,6个OBPs与瓜实蝇(Zeugodacus cucurbitae)的OBPs亲缘关系较近,柑橘大实蝇(Bactrocera minax)次之。半定量RT-PCR检测显示,6个OBPs在雌、雄虫不同组织中均有表达,而OBP14在雄虫腹部不表达,OBP15在雌虫腹部不表达。【结论】上述研究结果为进一步研究南瓜实蝇嗅觉识别分子机制和引诱机制奠定了基础。

利用RT-PCR和RACE方法克隆获得瓜实蝇Bactrocera cucurbitae(Coquillett)普通气味结合蛋白(general odorant binding protein,GOBP)基因的cDNA全长序列,命名为BcucOBP。测序结果表明,BcucOBP开放阅读框全长447 bp,编码149个氨基酸。氨基酸序列比对及三维结构同源建模表明,此序列具有OBPs的典型特征,序列中具有6个保守的半胱氨酸和6个α螺旋区域。构建了重组表达载体pET28a(+)-BcucOBP,并转化大肠杆菌BL21(DE3)中。SDS-PAGE及Western blotting分析表明,在IPTG进...

对斑翅果蝇非典型嗅觉受体(Orco)基因的理化性质、亚细胞定位、跨膜结构、信号肽、磷酸化位点、保守结构域、亲疏水性、蛋白功能、二级和三级结构及同源进化等进行分析.结果显示,斑翅果蝇Orco基因编码的蛋白质有486个氨基酸,相对分子质量为54 271.14 u,等电点为8.69.亚细胞主要定位于其他细胞器,不属于分泌蛋白;无信号肽序列,有7个跨膜结构和1个Pfam 7tm_6的结构域;Orco蛋白的二级结构中,α螺旋占50.21%,直链延伸占20.16%,β转角占8.64%,无规则卷曲占20.99%;三级结构主要由α螺旋和无规则卷曲缠绕折叠形成.

【目的】松针鞘瘿蚊是近几年新发现入侵我国的林业有害生物,已经在山东省青岛市黄岛区造成了以黑松为主的沿海防护林大面积衰弱枯死。作为新入侵种对于松针鞘瘿蚊的防控基础研究极为薄弱,为了研发有效的防控技术,尽快遏制该虫的严重危害,避免进一步扩散,本文从松针鞘瘿蚊的寄主识别机制出发,以期开发针对性的引诱剂来进行监测诱杀。【方法】本研究基于松针鞘瘿蚊触角转录组数据筛选到的气味结合蛋白TjapOBP1的序列,通过同源模建的方法,得到了蛋白三维结构模型,利用Procheck、Verify_3D和ERRAT程序评估模型的可靠性。通过AutoDock软件将TjapOBP1与黑松针叶挥发物中测得的67种气味分子进行分子对接。【结果】同源模建结果显示,模建蛋白的氨基酸有95.5%落在最佳合理区,83.3%的氨基酸评分大于0.2,模建结构的误差值在73.2%,这表明此次构建的松针鞘瘿蚊气味结合蛋白TjapOBP1三维模型有很高的可靠性。分子对接结果显示,β-月桂烯与TjapOBP1的结合效果最好,结合能为-5.26;另外,2,6-二甲基辛-1,5,7-三烯-3-醇、乙酸橙花酯、桧烯、乙酸薰衣草酯和1-异丙基-4-亚甲基二环[3.1.0]己-2-烯,这5种化合物与TjapOBP1的结合能依次升高,但均在-5.0以下。上述6种化学物质均有可能是能够被松针鞘瘿蚊TjapOBP1识别并结合的气味物质。【结论】三维结构模型的构建,为进一步研究松针鞘瘿蚊OBP的功能奠定基础。分子对接初步筛选了可能与TjapOBP1特异性结合的寄主挥发物,从而为引诱剂的开发提供支撑。

针对重要农业害虫大螟,通过序列相似性分析从转录组数据获得2个普通气味结合蛋白(general odorant-binding protein,GOBP)基因cDNA片段,利用RACE技术进一步得到cDNA全长,分别命名为SinfGOBP1和SinfGOBP2。2个基因编码的氨基酸序列和已报道的昆虫同源序列具有较高的相似性,其中SinfGOBP1和黄地老虎、小地老虎的相似性最高,分别为91%和90%;SinfGOBP2和谷实夜蛾、甘蓝夜蛾的相似性最高,均为87%。进化分析表明,不同昆虫GOBP被明显分为GOBP1和GOBP2两个亚组,暗示2个亚组GOBP在功能上的分化;此外,相同亚组内GOBP基...

【目的】利用昆虫的嗅觉识别机制,以化学感受蛋白作为潜在的靶标,干扰昆虫的寄主定位及交配等行为,用于害虫综合治理。【方法】克隆并纯化了1个新的苜蓿盲蝽化学感受蛋白Alin-CSP6,进行了113种气味化合物对Alin-CSP6的荧光竞争性结合试验,将荧光竞争结合试验筛选出强结合力的气味标样采用"Y"型嗅觉仪验证行为反应,并采用同源建模的方法构建Alin-CSP6的3D结构。【结果】Alin-CSP6具有较广谱的结合力,能够与醇、醛、酮、酯、萜、芳香族等多种化合物结合并表现较强的结合能力。其中,β-香茅醇(β-citronellol)、反式-2-己烯醛(trans-2-hexene aldehyd...

【目的】研究白蜡窄吉丁气味结合蛋白AplaOBP2在触角中的表达定位,解析AplaOBP2重组蛋白的配体结合特性及配体活性,旨在通过气味结合蛋白筛选白蜡窄吉丁新的信息化合物。【方法】原核表达白蜡窄吉丁气味结合蛋白AplaOBP2,采用免疫组织化学技术研究AplaOBP2在白蜡窄吉丁触角中的表达定位,通过荧光竞争结合试验分析AplaOBP2重组蛋白与58种化合物的结合特性,并进一步通过触角电位仪和"Y"型嗅觉仪测定AplaOBP2的配体对白蜡窄吉丁成虫的活性。【结果】在原核表达系统中成功表达AplaOBP2重组蛋白。免疫定位结果显示AplaOBP2在触角嗅觉感器——锥形感器Ⅰ的淋巴液表达。荧光竞争结合试验结果表明,AplaOBP2蛋白能够与反-2-己烯醛、反-2-庚烯醛、苯甲醛、4′-乙基苯乙酮、3′,4′-二甲氧基苯乙酮和β-紫罗兰酮6种配体结合,其解离常数KD值分别为4.44,4.17,5.20,2.91,3.45和0.63μmol·L-1。白蜡窄吉丁雌雄成虫对10 mg·mL~(-1)的6种配体均有触角电位反应。行为学试验表明,在10 mg·mL~(-1)刺激剂量条件下,反-2-己烯醛对雌成虫有显著引诱作用,β-紫罗兰酮对雌虫表现出明显的趋避作用。【结论】白蜡窄吉丁气味结合蛋白AplaOBP2在嗅觉感器表达,能够选择性结合醛类和酮类物质,推测其在嗅觉识别中发挥功能。气味结合蛋白可作为靶蛋白,鉴定对白蜡窄吉丁具有吸引或趋避活性的信息化合物。

【目的】中华蜜蜂（Apis cerana cerana，简称中蜂）是我国本土蜂种，也是重要的传粉昆虫和经济昆虫。气味结合蛋白（odorant binding protein,OBP）是蜜蜂嗅觉感知中的关键蛋白。在前人对中蜂AcerOBP7基因序列特征分析的基础上，本研究进一步对其表达特性及与气味物质的结合能力进行探究，为揭示气味结合蛋白在中蜂嗅觉系统中的作用提供基础数据。【方法】采用qRT-PCR检测AcerOBP7在工蜂不同组织和发育阶段的表达特性；通过原核表达系统获得AcerOBP7融合蛋白，使用Ni-NTA柱进行蛋白纯化；采用荧光竞争结合法，以1-NPN(N-phenyl-1-naphthylamine)为荧光探针，测定AcerOBP7与信息素及植物挥发物的结合能力；设计并合成ds AcerOBP7，采用饲喂法对该基因进行沉默，通过qRT-PCR测定沉默效率；结合RNAi，利用EAG检测并比较对照组与干扰组中蜜蜂触角对待测物质反应值的差异。【结果】qRT-PCR结果显示，AcerOBP7mRNA在工蜂触角中的表达量极显著高于其他组织（P<0.05）。【结论】AcerOBP7在中蜂采集蜂触角中高表达，重组蛋白能与多种气味分子结合，表明AcerOBP7是一种广谱型结合蛋白，推测其可能在工蜂采集和哺育蜂王的行为中发挥着重要作用。另外，1-辛烯-3-醇、壬醛、桉树脑和9-ODA可能是AcerOBP7结合特异性较高的配体物质。

【目的】探究AcinJHBP基因在春尺蠖生长发育与滞育中的作用。【方法】基于前期所测春尺蠖蛹转录组数据（非滞育蛹-滞育蛹与滞育蛹-滞育解除蛹），克隆获取JHBP基因，命名为AcinJHBP（GenBank登录号: OR860357）；利用生物信息学软件分析AcinJHBP基因的序列特征及理化性质；采用qPCR技术检测AcinJHBP的时空表达（不同发育阶段和组织）情况。【结果】春尺蠖AcinJHBP基因完整CDS序列全长726 bp，编码241个氨基酸，蛋白质预测分子量为26.97 kDa，预测等电点为5.13。春尺蠖AcinJHBP基因预测分子式为C_(1211)H_(1915)N_(313)O_(364)S_(9)，负电荷残基(Asp + Glu)总电荷为34，正电荷残基（Arg + Lys）总电荷为26，半衰期和脂肪指数分别为30 h和97.51。该蛋白的平均亲水性为-0.098，预测不稳定系数为27.13，故该蛋白属于亲水稳定蛋白，N端氨基酸为蛋氨酸（Met， M）。AcinJHBP在N端含一个长为17个氨基酸残基的信号肽，但无跨膜区；磷酸位点检测分别发现丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸磷酸位点分别为9、6和3个，未发现糖基化位点。亚细胞定位结果显示，其主要位于细胞外。系统进化结果表明，AcinJHBP与同为鳞翅目尺蛾科的冬尺蠖（Operophtera brumata）血淋巴保幼激素结合蛋白JHBP亲缘关系最近。基因表达结果显示，在不同发育阶段，AcinJHBP基因在春尺蠖卵～5龄幼虫期间表达均较低（3龄幼虫除外），且无显著差异（P＞0.05），而在非滞育蛹-成虫期，AcinJHBP表达量呈逐渐下降趋势。在不同组织中，春尺蠖AcinJHBP基因在雄虫头部表达量最高。【结论】AcinJHBP基因与春尺蠖生长发育与滞育密切相关，该结果为进一步揭示该基因在春尺蠖蛹越夏、越冬滞育中的功能奠定了一定理论基础。

C1q结合蛋白(C1qBP)是补体系统中的一种重要成分,它能与游离的补体分子C1q的胶原样区相互作用并启动多种细胞反应,包括增强吞噬作用、促进吞噬细胞对微生物的杀伤、诱导趋化作用,从而增强生物体的免疫性。本实验从构建的斑节对虾(Penaeus monodon)卵巢组织cDNA文库中筛选并克隆了PmC1qBP基因。为研究PmC1qBP在斑节对虾中的生物学功能,采用半定量和荧光定量的方法研究比较了PmC1qBP基因在雌雄个体不同组织及卵巢不同发育阶段的差异表达情况。结果表明:雌雄个体的PmC1qBP基因在性腺、胃、血细胞、肠中表达量存在极显著差异(P<0.01)。同时,PmC1qBP在无节幼体和蚤...

【目的】研究中华蜜蜂(Apis cerana cerana)体外重组普通气味结合蛋白AcerASP2与不同气味信息的结合功能和模式。【方法】通过诱导条件的优化和纯化,在获得的重组AcerASP2蛋白基础上,研究竞争性荧光探针1-NPN及不同结构气味信息与蛋白的相互作用关系,并通过同源建模和分子对接解析蛋白与气味信息的结合模式和机理。【结果】通过条件摸索获得了可溶性表达的重组中蜂ASP2蛋白,荧光光谱分析1-NPN与AcerASP2的解离常数K1-NPN为7.38μmol.L-1,结合位点数n为1.0321。在7种气味信息中,4-烯丙基藜芦醚亲和力最强,其IC50和解离常数KD分别达到7.09和...

【目的】克隆Q型烟粉虱(Bemisia tabaci)化学感受蛋白1(chemosensory protein 1,CSP1)基因,诱导表达Q型烟粉虱CSP1重组蛋白(以下简称Bt CSP1),研究其与主要寄主植物挥发性气味分子的结合特性。【方法】利用全长引物通过RT-PCR扩增并克隆Q型烟粉虱CSP1基因ORF全长,连接并构建p ET-30a(+)原核表达载体,转化入BL21(DE3)大肠杆菌感受态细胞,并用IPTG诱导表达Bt CSP1重组蛋白。收集菌液后超声破碎细胞,离心取上清,经Ni2+-琼脂糖柱结合梯度浓度咪唑洗脱纯化后,经PBS反复透析获得重组蛋白,并用Bradford法测定重组蛋...

测试了斑翅果蝇寄主水果11种挥发性成分(己醛、2-庚酮、反式-2-己烯醛、芳樟醇、乙酸乙酯、水杨酸甲酯、己酸、α-紫罗兰酮、己醇、反式-2-己烯-1-醇和乙酸异戊酯)分别与一定比例的乙醇和乙酸混合对斑翅果蝇成虫的引诱效果,以筛选出对乙醇和乙酸混合液具有增效作用的挥发物,并对具有增效作用的挥发物进行正交试验,以找出具有最佳引诱效果的配方.结果表明:将一定浓度的己醛、2-庚酮、反式-2-己烯醛和芳樟醇添加到乙醇和乙酸中对斑翅果蝇雌雄成虫的引诱具有显著的增效作用;正交试验结果表明,以各种挥发物作为溶质,乙醇和乙酸混合液作为溶剂,将体积分数为1/5 000的己醛、1/500的2-庚酮和1/5 000的芳樟醇混合到乙醇和乙酸中对斑翅果蝇的引诱效果最好,引诱率达到86.4%.