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[期刊] 水产学报
[作者]
黄锋涛 熊海林 曹胜波 熊传喜 王敏 王卫民 吴兵 刘玉林 刘学芹
为构建基于杆状病毒表达系统的CCV新型亚单位疫苗,将CCV的囊膜蛋白基因ORF6克隆至杆状病毒转座载体pFastBacTM 1质粒中,并将阳性重组转座质粒转化进含穿梭载体Bacmid的感受态细胞DH10Bac中,获得重组子rBacmid-ORF6。在脂质体介导下将该重组子转染sf9昆虫细胞,获得重组杆状病毒AC-ORF6。AC-ORF6感染的sf9昆虫细胞,经超薄切片电镜观察,可见重组杆状病毒呈多粒包埋,经间接免疫荧光、Western-blotting检测,CCV的ORF6蛋白可以在感染了AC-ORF6的sf9细胞中表达。研究表明,获得了插入ORF6基因的重组杆状病毒,并且该基因可以在重组杆状...
[期刊] 华中农业大学学报
[作者]
王树云 陈孝煊 王敏 周金敏 于艳梅 岳刚毅 李莉娟
为获得斑点叉尾鮰疱疹病毒ORF6和ORF10基因,设计特异性引物进行PCR扩增,成功构建pET-32a-ORF6和pET-32a-ORF10原核表达载体,经IPTG诱导后目的蛋白在大肠杆菌中成功表达并制备多抗,通过Western blot证明ORF10的抗体具有特异性,且ORF10为病毒的结构蛋白。
[期刊] 华中农业大学学报
[作者]
郭露玲 刘海滨 石剑 李谷 肖庚富
通过RT-PCR获得了传染性造血组织坏死症病毒(infectious hematopoietic necrosis virus,IHNV)囊膜糖蛋白(G蛋白)基因,并将其克隆入新型MBP(麦芽糖结合蛋白)融合表达质粒pMAL-c2X,构建重组质粒pMAL-c2X/IHNV-G并转入大肠杆菌Rossetta-gami2(DE3)splyS。经IPTG诱导后,表达出包含全长G蛋白在内、预期分子质量为99 ku的融合蛋白。基于anti-MBP抗体的Western blot鉴定证实表达蛋白存在。
[期刊] 渔业科学进展
[作者]
张淑敏 白昌明 辛鲁生 李亚楠 李晨 王崇明
本研究对编码牡蛎疱疹病毒(Ostreid herpesvirus 1,OsHV-1)囊膜蛋白的orf111基因进行了生物信息学分析、克隆和表达。首先,通过特异性PCR扩增得到orf111基因全长序列,并对其编码囊膜蛋白的理化性质、高级结构、跨膜区和抗原决定簇等进行生物信息学分析。结果显示,orf111编码一种稳定的疏水性蛋白,具有5个跨膜结构域和9个抗原决定簇,同时,氨基酸序列中还包含1个高度保守的精氨酰-甘氨酰-天冬氨酸(Arg-Gly-Asp, RGD)结构域。随后,构建了pET28a-orf111重组质粒,并将其转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞中。最后,通过使用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导蛋白表达,表达产物分子量约为32 kDa。本研究应用原核表达得到了含RGD结构域的OsHV-1囊膜蛋白,为进一步制备ORF111蛋白单克隆抗体及开展牡蛎疱疹病毒侵染机制的研究奠定了重要基础,为将来OsHV-1的防控工作提供新的思路。
关键词：
牡蛎疱疹病毒 囊膜蛋白 原核表达 魁蚶
[期刊] 水产学报
[作者]
李方 叶巧真 何建国 王莉真
A pair of primers was designed based on the vp28 gene and PCR was performed to amplify the gene from WSSV DNA. Inserting the DNA fragment to the yeast-E.coli shuffle vector pPICZ and the recombinant plasmid (pPICZVP28) that contains the target DNA fragment was obtained in the E.coli strain.The pPICZ...
[期刊] 中国水产科学
[作者]
赵建梅 唐小千 战文斌
为了鉴定对虾白斑病综合征病毒(WSSV)囊膜蛋白VP110在中国明对虾(Fenneropenaeus chinensis)鳃细胞中的结合蛋白,运用pET-32(a)+载体构建了1段含RGD模体的截短VP110原核重组表达质粒,转化大肠杆菌诱导表达后获得分子量为41 kD的截短重组VP110蛋白(rVP110)。以rVP110作为诱饵蛋白,运用pull-down实验结合蛋白质谱分析鉴定rVP110结合蛋白,结果显示,中国明对虾鳃细胞中的肌动蛋白和精氨酸激酶(arginine kinase,AK)与rVP110具有结合作用。利用PCR扩增中国明对虾AK编码基因,将其与表达载体pGEX-4T-1连接...
[期刊] 华北农学报
[作者]
王凤芝 温立斌 何孔旺 姚火春 王小敏
为了鉴定类猪圆环病毒P1 VP1蛋白能否在体外自组装成病毒样颗粒(VLPs),首先PCR扩增P1 ORF1基因,利用p Fast BacTM1载体构建重组质粒,通过脂质体转染在Sf9细胞中表达P1 ORF1基因。然后通过RT-PCR技术及Western Blot分别从转录和蛋白质水平上鉴定该基因的表达,应用透射电镜观察该蛋白质是否形成了VLPs。结果显示,转染Sf9细胞后,第5天开始出现细胞病变;从接毒细胞中提取总RNA,经Recombinant DNaseⅠ处理除去基因组DNA后,RT-PCR能够扩增出362 bp的目的片段;收获接毒后72 h的细胞,Western Blot分析显示,P1 ...
[期刊] 华北农学报
[作者]
瞿晓兰 王宏俊 陈小玲 章振华
以本实验室保存的REV毒株为模板,采用RT_PCR技术扩增了REV env部分基因,长为939 bp,并进行亚克隆到pMD18_T质粒载体上,连接、转化、鉴定后得到阳性重组质粒pET_env,将目的片段进行序列分析,结果表明,该REV的env基因与已发表的SNV株、中国HA9901株以及A株同源性均达94%以上,推导的氨基酸同源性为94%以上。将该基因片段与原核表达载体pET_32a重组,并将重组质粒转化至宿主菌BL21中,用IPTG诱导表达,对表达的蛋白用SDS_PAGE电泳,免疫印迹和薄层凝胶扫描分析,表达产物与理论推理一致;免疫印迹结果证明,表达的env蛋白可被REV阳性血清所识别。
[期刊] 华北农学报
[作者]
黄欣梅 李银 赵冬敏 刘宇卓 张敬峰 韩凯凯 钮慧敏
选取鹅黄病毒囊膜蛋白(E蛋白)基因进行克隆、表达和纯化,以获得能应用于血清学诊断和可作为亚单位疫苗的重组蛋白。根据鹅黄病毒JS804株全基因序列设计了1对引物,采用RT-PCR方法扩增出了鹅黄病毒的E基因,将其克隆到表达载体pET32a(+)中,构建了重组表达质粒pET32a-E,转化大肠杆菌BL21(DE3),并用IPTG进行诱导表达。结果表明,鹅黄病毒E基因在大肠杆菌中获得高效表达,融合蛋白分子量约为70 kDa,主要以包涵体形式存在于菌体中。Western Blot和间接免疫荧光试验发现,重组E蛋白具有较好的反应原性和良好的免疫原性。鹅黄病毒E蛋白的原核表达为进一步研究该蛋白功能、建立血...
关键词：
禽黄病毒 E蛋白 原核表达 抗原性
[期刊] 渔业科学进展
[作者]
耿小雪 王小霞 周怡 徐玮 张文兵 麦康森
近年来，重组ＶＰ２８和ＶＰ２６蛋白作为蛋白亚单位疫苗，在增强对虾抗白斑综合征病毒（ＷＳＳＶ）感染的过程中具有重要作用。本研究根据Ｇｅｎ Ｂａｎｋ中ＷＳＳＶ的基因序列设计引物，以ＷＳＳＶ粗提液为模板进行普通ＰＣＲ扩增，得到ＶＰ２８和ＶＰ２６基因，再用引物悬挂法将ｅＣｏ ＲⅠ和ＸＢａⅠ酶切位点分别添加到ＶＰ２８和ＶＰ２６基因的５端和３端。目的基因经双酶切后插入到表达载体Ｐ ＧａＰＺαａ，转化ＴｏＰ１０大肠杆菌，经博莱霉素（ＺｅｏＣｉｎ）抗性筛选阳性重组酵母表达载体。ａＶＲⅡ酶切线性化之后，电击转化Ｘ－３３毕赤酵母感受态细胞，经ＺｅｏＣｉｎ抗性筛选得到阳性重组酵母。ＳＤＳ－ＰａＧｅ电泳分析重组酵母表．．．
[期刊] 水产学报
[作者]
罗卫 田飞焱 刘荭 陈焕春 李惠芳 刘宗晓 王侃 蔡伊娜 吕建强
利用RT-PCR技术获得病毒性神经坏死病毒0603株的衣壳蛋白基因,将其插入到杆状病毒Bac-To-Bac表达系统的pFastBacⅠ质粒中,构建了pFastBac-cp质粒。转化DH10Bac大肠杆菌后获得重组穿梭载体Bacmid-cp,脂质体介导将其转染Sf9细胞产生有感染性的重组杆状病毒AcNPV-cp。利用AcNPV-cp感染Sf9细胞后,SDS-PAGE分析可见大小约为37ku的特异性蛋白带,Western-blotting分析发现,其可以与病毒性神经坏死病毒阳性血清反应出现特异性的杂交带。试验结果表明,AcNPV-cp在Sf9细胞中成功地表达了病毒性神经坏死病毒的衣壳蛋白,其具有良...
关键词：
病毒性神经坏死病毒 衣壳蛋白 病毒样颗粒
[期刊] 渔业科学进展
[作者]
张平 李晨 黄倢 梁艳 刘庆慧 刘莉
将VP110基因的部分序列克隆到pET-28a载体中构建pET28a-vp110b重组质粒并进行原核表达,获得重组表达的蛋白rVP110-B;用rVP110-B注射凡纳滨对虾Litopenaeus vannamei后,经WSSV感染,实验表明,该蛋白注射使凡纳滨对虾感染WSSV的半数死亡时间比对照组延长了20%。用表达纯化的该重组蛋白制备了兔抗rVP110-B多克隆抗体,该抗体用于凡纳滨对虾鳃细胞膜蛋白与rVP110-B的Far-western分析显示,凡纳滨对虾鳃细胞膜蛋白中除90 kDa左右的血蓝蛋白外,在41.7 kDa存在结合条带,经质谱分析表明这条鳃细胞膜蛋白是肌动蛋白。
[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
李菁 何孔旺 杨倩
用RT-PCR方法扩增出猪传染性胃肠炎病毒S基因主要抗原位点A、D,将其亚克隆至供体质粒pFastBac1,得到重组转移质粒pFastBac1-TS1,转化到Escherichia coliDH5α中,提取阳性克隆质粒再转化到含穿梭载体bacmid的E.coliDH10Bac中,发生转座作用,经蓝白斑筛选得到重组穿梭载体Bacmid-TS1,经PCR鉴定后再转染Sf9昆虫细胞,经空斑筛选得到纯化的重组病毒rAcV-Bac-TS1,经IFA、SDS-PAGE和Western-blot鉴定,重组杆状病毒TS1蛋白(相对分子质量约43 000)在Sf9昆虫细胞中得到表达。
[期刊] 上海水产大学学报
[作者]
王永杰 潘庭双 李艳和 佘磊
白斑综合征病毒(WSSV)是一种已给世界养虾业造成了严重危害的病原体。根据GenBank上公布的WSSV囊膜蛋白基因VP31的序列,设计并合成特异引物,PCR扩增得到VP31基因,大小为783 bp。通过引物两端的BamHⅠ和EcoRⅠ酶切位点连接该基因,然后将其构建到家蚕杆状病毒表达载体pFASTBAC HTB上。重组的家蚕杆状病毒转染5龄家蚕幼体内表达,表达产物经SDS-PAGE检测,显示与预期31 kD大小相吻合的蛋白带。用Ni2+柱纯化该蛋白免疫新西兰大白兔制备抗体,肌肉注射克氏鳌虾进行活体中和病毒试验。中和试验结果显示,囊膜蛋白VP31与白斑综合征病毒的侵染性相关,对病毒的侵染性可能...
[期刊] 水产学报
[作者]
贾睿 朱婵 庄旻敏 廖圣瑜 施定基 何培民
自二十世纪90年代,白斑综合征病毒(WSSV)就因其暴发范围广、致死率高得到了广泛的关注。研究主要集中在确定该病毒蛋白的结构及功能,以及利用其囊膜蛋白制备亚单位疫苗、研发DNA疫苗等来提高对虾抵抗白斑综合征病毒的能力,尽管免疫防治目前在实验室阶段已取得了显著的保护效果,但因其给药方式局限以及成本较高等因素一直没有应用于实际生产中。VP19和VP28是白斑综合征病毒主要的囊膜蛋白,在WSSV感染对虾的过程中起着非常重要的作用。本文从WSSV的基因组学、VP19和VP28的蛋白质结构及其在免疫防治中的应用等方面概述了VP19和VP28的研究进展,包括蛋白亚单位疫苗、DNA疫苗、RNA疫苗以及相关抗体的研究。在总结了不同类型疫苗的保护效果后发现,VP19和VP28的双价疫苗的保护率较高,为今后制定有效的WSSV控制方法提供了参考。
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