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[期刊] 水产学报
[作者]
汪开毓 王均 肖丹 陈德芳 黄锦炉 黄凌远 付希 王浩丞
以Primer p14(5'-GATCAAGTCC-3')为引物对分离自患病斑点叉尾海豚链球菌强毒株DGX07进行RAPD分析。同时参照GenBank中海豚链球菌simA基因序列设计特异性引物,以DGX07基因组DNA为模板,扩增出约1 500 bp的simA基因,并将其克隆到pMD19-T载体上,之后对重组质粒进行PCR和双酶切(BamHⅠ+XhoⅠ)鉴定,鉴定正确后送测序公司测序。RAPD分析结果显示,DGX07和标准菌株均能扩增出750 bp大小的条带。通过生物信息学软件对测序结果分析显示,simA基因全长1 566 bp,由521个氨基酸组成,与海豚链球菌simA和simB亲缘性达1...
[期刊] 水产学报
[作者]
汪开毓 付希 肖丹 黄锦炉 王均 王浩丞
利用特异性引物,采用PCR扩增出分离自患病罗非鱼无乳链球菌强毒株的cpsE基因,将其克隆到pMD19-T载体上,通过菌落PCR鉴定和利用限制性内切酶BamHⅠ和HindⅢ对重组质粒进行双酶切鉴定之后送测序公司测序,并利用生物信息学软件C lustal X 2.0、MEGA4.1、B ioed it 7.0、TMHMM、NetPhos 2.0、NetNG lyc 1.0、SignalP 3.0 Server、PSIpred、SAM_T08以及CUSP等分析cpsE基因的分子特性。结果显示,罗非鱼源无乳链球菌cpsE编码氨基酸序列具有高度保守性,与人源、动物源无乳链球菌亲缘性达100%,具有1个参...
关键词：
无乳链球菌 cpsE基因 克隆 分子特性
[期刊] 上海海洋大学学报
[作者]
郑宗林 汪开毓 肖孟玮 王均 李岚敏 贺扬 陈德芳 黄凌远
采用饱和硫酸铵法对斑点叉尾IgM进行粗提,用亲硫树脂对IgM进行纯化,将纯化的IgM免疫家兔,并用ELISA检测兔抗斑点叉尾IgM抗体效价;制备重组C5a肽酶(pSCPI),分别用1、2和3μg/g的抗原免疫斑点叉尾,以PBS作为对照;测定了第21、28、35、42和49天斑点叉尾产生的特异性抗体的水平,并于免疫后第4周用海豚链球菌DGX07株进行攻毒。结果显示:通过亲硫树脂亲和层析后得到了较纯的IgM重链和轻链,分别约70ku和27ku,浓度达到6.4mg/mL,免疫家兔后的兔抗斑点叉尾IgM抗体效价达1∶51200;重组蛋白pSCPI免疫斑点叉尾后第3周抗体水平开始增加,第4周...
[期刊] 淡水渔业
[作者]
赵长臣 江小燕 刘春花 张德峰 罗霞 曾伟伟 陈总会 黄志斌
为查明梭鲈(Lucioperca lucioperca)凸眼病病原,从患病梭鲈病灶眼、肝、脾和肾分离纯化病原菌,进行了生理生化特性测定及16S rRNA基因序列分析,并开展人工感染试验,测定其血清型及MLST分型,并利用纸片扩散法进行药敏特性分析。结果显示:分离菌株(命名为SL1701株)为本次引发梭鲈病害的致病菌,Ib-ST261型。回归感染实验证实,分离得到的细菌SL1701对健康梭鲈具有非常强的致病性,4.5×105CFU/m L时可使80%受感染梭鲈死亡,并可复制出自然发病鱼的症状。菌株SL1701革兰氏染色为阳性链球菌,γ溶血,生理生化特性与普通无乳链球菌基本一致,16S rRNA基因序列与无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)同源性最高,综合判定分离菌株为无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)。药敏试验结果显示:分离菌株SL1701对氟苯尼考、氟罗沙星等17种抗生素高度敏感,对青霉素、磷霉素等8种抗生素耐药。结果表明,分离菌株SL1701为Ib-ST261型无乳链球菌,养殖时可选用氟苯尼考及氟罗沙星等药物进行防控。
[期刊] 华中农业大学学报
[作者]
罗璋 许杰 韩进刚 徐赟霞 马文婷 冯守明
从患病濒死的银鼓鱼(Selenotoca multifasciata)肾脏组织中分离到Yg1菌株,用该菌株对健康银鼓鱼进行人工感染,可使其致病,发病症状与自然病鱼症状一致,再分离菌株的各种特性与原分离菌株相同。通过ATB系统和菌体常规形态特征、生理生化反应指标测定以及16SrRNA测序分析等综合鉴定,Yg1菌株为海豚链球菌(Streptococcus iniae)。药敏试验结果表明,Yg1菌株对恩诺沙星、土霉素、罗红霉素、强力霉素、四环素、左氟沙星等抗生素较为敏感。
[期刊] 华北农学报
[作者]
阚威 王华 马友记 赵兴绪 张勇
为研制奶牛乳房炎无乳链球菌的基因工程疫苗,采集隐性奶牛乳房炎奶样,利用THB(Todd-Hewitt Broth)固体选择培养基和色素试验,并结合无乳链球菌种属特异性基因cfb,采用PCR技术从隐性乳房炎奶样中分离和鉴定无乳链球菌。根据GenBank已报道的链球菌cfb基因序列,经ORF分析和B细胞表位预测,利用Primer 5.0软件设计cfb因子富含B细胞表位区域引物,添加酶切位点和真核表达元件,以分离株无乳链球菌的基因组为模板,PCR扩增cfb基因并连接T载体克隆测序,经测序确定无误后,连接pcDNATM3.1 V5-His A(pcDNA-cfb)真核载体,转化DH5α感受态细胞,提取...
[期刊] 上海海洋大学学报
[作者]
孙国荣 马少鸿 林桂香 万小菊 黄郁葱 简纪常 蔡双虎
基于荚膜多糖cpsA基因设计引物，建立海豚链球菌可视化环介导等温扩增（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）技术，以快速检测鱼类养殖中的海豚链球菌。结果表明，LAMP最佳反应条件为65 ℃反应20 min，镁离子浓度为1.2 mmol/L、dNTPs浓度为0.64 mmol/L、内外引物比例为 16:1；特异性检测结果表明：该方法能特异性检出海豚链球菌，对无乳链球菌和其他14种菌检测结果均呈阴性；灵敏度检测结果表明，该LAMP方法灵敏度为21.2×10~(-6) ng/μL，比PCR检测方法灵敏度高100倍；适用性分析结果表明，该LAMP方法在模板中存在鱼类基因组干扰下也能正确完成检测。研究中建立的LAMP检测方法为海豚链球菌的检测提供一种可视化、灵敏、成本低的快速检测技术。
关键词：
海豚链球菌cpsA LAMP 可视化检测
[期刊] 水产学报
[作者]
甘西 陈明 余晓丽 李莉萍 陈汉忠 徐增辉 雷爱莹 梁万文 黄维义
为了从分子水平上对1株致病性罗非鱼链球菌进行分类学鉴定,利用原核生物16SrRNA基因通用引物对分离纯化的罗非鱼致病性链球菌进行16S rRNA基因的克隆及序列分析。结果扩增出长约1.5 kp目的片段,测序得到1条长度为1 447 bp核苷酸序列。核苷酸相似性分析表明,序列与NCB I公布的海豚链球菌(Streptococcus iniae,S.iniae)SCCF5L菌株16SrRNA基因核苷酸序列相似性最高(99.4%),暂称为中国广西株(S.iniae-CGX)。同时,亲源关系较近的S.iniae、S.difficilis和S.agalactiae代表菌株构建的系统发育进化树显示,所得菌...
[期刊] 水产学报
[作者]
刘韬 陈德芳 段靖 王二龙 王亚军 汪开毓
为检测斑点叉尾鮰源海豚链球菌兼职蛋白(fructose-1,6-bisphosphate aldolases,FBA)的抗原性和潜在的疫苗价值,本实验克隆得到斑点叉尾鮰源海豚链球菌DX09(基因组登陆号LXQF01)的fba基因序列(基因登录号A7N10_RS06935),对克隆序列进行生物信息学分析,并通过原核表达得到重组FBA蛋白(r FBA),制备了兔抗r FBA血清用于FBA蛋白抗原性检测,同时通过免疫保护实验评估重组蛋白的免疫保护效果。结果显示,海豚链球菌DX09 fba基因有1个882 bp的开放阅读框(ORF),编码293个氨基酸。生物信息学分析显示,其分子式为C_(1378)H_(2172)N_(368)O_(422)S_8,分子质量为30.9 ku,理论等电点为5.01,不具有信号肽和跨膜区域;具有保守的裂解酶结构域,且与其他来源的FBA蛋白同源性达100%;具有较高的抗原指数,表明其可形成多个抗原表位。SDS-PAGE检测发现,诱导表达的重组蛋白以包涵体的形式出现在沉淀中,大小约为47 ku。Western blot分析表明,兔抗r FBA血清能特异性结合菌体蛋白。同时免疫保护实验显示,重组蛋白对斑点叉尾鮰的相对保护率可达55%,免疫后鱼体抗体水平相对对照组显著升高。本研究表明,原核表达的斑点叉尾鮰源海豚链球菌DX09 rFBA具备较好的抗原性和免疫保护作用,具有研发斑点叉尾鮰海豚链球菌亚单位疫苗的潜在价值。
[期刊] 水产学报
[作者]
邓梦玲 耿毅 刘丹 周燕 汪开毓 黄小丽 陈德芳 余泽辉 陈成
2013年8—9月,四川雅安汉源湖养殖的西伯利亚鲟发生一种以体表溃疡、内脏出血和心外膜囊肿为特征的传染病。为明确其病因,本研究从自然发病鱼的肝、脾和肾进行了病原菌的分离、人工感染、分离菌的表型特征和分子生物学特征的检测。结果从患病鱼体内分离到一株G+链状球菌(Ab130920),人工感染实验证实了其病原性,生理生化特性与海豚链球菌(ATCC29178)基本一致;16S r DNA序列(Gen Bank登录号:KJ162337)与Gen Bank中S.iniae16S r DNA序列同源性最高,在以16S r DNA序列及其Gen Bank中同源性较高的相关序列构建的系统发育树上,分离菌与海豚链...
[期刊] 中国农业科学
[作者]
范红结 陆承平 唐家琪
目的阐明国内不同区域猪源马链球菌兽疫亚种分离株类M基因的特性,为疫苗研制提供指导。方法利用PCR技术,扩增国内9省市从1974～2003年分离的9株马链球菌兽疫亚种类M基因,并进行克隆、测序及序列分析。结果发现7株类M基因长度为1137bp,含一个阅读框,CG-74-63和CP-0104株的长度分别为1143bp及1125bp。除1株关节炎分离株CP-0104外,引致败血症的8株菌类M基因的核苷酸同源性高达95.4%～99.9%,推导的相应氨基酸序列同源性高达92.1%～100%。9株猪源菌与马源菌株及人源菌株类M基因的核苷酸同源性分别为81.6%～87.0%、81.7%～91.8%。9株猪源...
关键词：
马链球菌兽疫亚种 类M基因 分析
[期刊] 渔业科学进展
[作者]
姚学良 徐晓丽 李贺密 钟文慧 臧莉 李灏 杨超敬
为查明天津地区养殖红尾皇冠鱼(Aequidens rivulatus)大量死亡的原因,取患病红尾皇冠鱼进行细菌分离,从病鱼肾脏中分离到优势菌株071901,人工感染试验证实其对红尾皇冠鱼有较强的致病性;采用形态学观察、生理生化特性、16S r RNA基因序列系统发育树分析及cfb(GBS-specific gene cfb,CAMP factor)基因检测对菌株071901进行鉴定。结果显示,菌株071901为革兰氏阳性球菌,生化特性与链球菌属的无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)相近,基于16S r RNA基因序列的系统发育分析将菌株071901与无乳链球菌聚为一支...
[期刊] 渔业科学进展
[作者]
姚学良 徐晓丽 李贺密 钟文慧 臧莉 李灏 杨超敬
为查明天津地区养殖红尾皇冠鱼（Ａｅｑｕｉｄｅｎｓ ｒｉｖｕｌＡｔｕｓ）大量死亡的原因，取患病红尾皇冠鱼进行细菌分离，从病鱼肾脏中分离到优势菌株０７１９０１，人工感染试验证实其对红尾皇冠鱼有较强的致病性；采用形态学观察、生理生化特性、１６ｓ ｒ ｒｎＡ基因序列系统发育树分析及ｃｆｂ（Ｇｂｓ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｇｅｎｅ ｃｆｂ，ｃＡＭｐ ｆＡｃｔｏｒ）基因检测对菌株０７１９０１进行鉴定。结果显示，菌株０７１９０１为革兰氏阳性球菌，生化特性与链球菌属的无乳链球菌（ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ＡＧＡｌＡｃｔｉＡｅ）相近，基于１６ｓ ｒ ｒｎＡ基因序列的系统发育分析将菌株０７１９０１与无乳链球菌聚为一支．．．
[期刊] 华中农业大学学报(自然科学版)
[作者]
朱霞 杨移斌 张蕾 胥宁 艾晓辉
为探究白细胞介素-22(interleukin-22,IL-22)基因编码序列(coding sequence,CDS)的分子特征以及在不同病原微生物胁迫下IL-22的响应情况,以斑点叉尾鮰为(Ictalurus punctatus)研究对象,采用PCR扩增技术对该序列进行克隆,通过实时荧光定量PCR(qRT-PCR)方法分析各组织分布以及不同诱导模式下IL-22mRNA表达量的变化情况。结果显示:该序列CDS长度为534 bp,编码177个氨基酸;氨基酸序列多重比对分析发现IL-22在鱼类进化中与脊椎动物保守性较高。qRT-PCR结果显示,IL-22广泛分布在斑点叉尾鮰的10个组织中,表达量在后肠中最高,心脏中最低。Poly(I:C)、LPS、PHA、PMA刺激斑点叉尾鮰肾细胞24～48 h后,Poly(I:C)和LPS刺激下IL-22呈上调反应,PHA、PMA刺激下IL-22呈下调反应;细菌、病毒注射实验以及溴氰菊酯浸泡鱼体的攻毒实验结果显示,鳃、皮肤、后肠、脾脏、中肾和头肾组织中IL-22表达量整体上调。上述结果表明,不同刺激下不同组织中IL-22表达模式具差异性,该基因可能参与黏膜和多种免疫反应且发挥关键作用。
[期刊] 湖南农业大学学报(自然科学版)
[作者]
黎炯 叶星 卢迈新 邓国成 田园园 江小燕 黎坚平
根据无乳链球菌的cfb基因和海豚链球菌16SrRNA基因序列,设计、合成2对引物,优化扩增条件,建立了快速鉴别无乳链球菌和海豚链球菌的双重PCR方法.用该方法扩增无乳链球菌和海豚链球菌,可分别获得474、296bp的特异性片段,扩增嗜水气单胞菌、铜绿假单胞菌等其他常见鱼病原菌无特异性片段.该方法可实现对无乳链球菌和海豚链球菌的快速鉴别,具较高的灵敏度,可检测到基因组含量分别为3.2×10-3ng/μL的无乳链球菌和3.0×10-2ng/μL的海豚链球菌.对采集自广东与海南两省养殖罗非鱼病鱼的11份病原样品进行检测,均可获得474bp片段,测序与BLAST分析结果表明,扩增到的序列均为无乳链球菌...
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