为获得斑点叉尾鮰疱疹病毒ORF6和ORF10基因,设计特异性引物进行PCR扩增,成功构建pET-32a-ORF6和pET-32a-ORF10原核表达载体,经IPTG诱导后目的蛋白在大肠杆菌中成功表达并制备多抗,通过Western blot证明ORF10的抗体具有特异性,且ORF10为病毒的结构蛋白。

为构建基于杆状病毒表达系统的CCV新型亚单位疫苗,将CCV的囊膜蛋白基因ORF6克隆至杆状病毒转座载体pFastBacTM 1质粒中,并将阳性重组转座质粒转化进含穿梭载体Bacmid的感受态细胞DH10Bac中,获得重组子rBacmid-ORF6。在脂质体介导下将该重组子转染sf9昆虫细胞,获得重组杆状病毒AC-ORF6。AC-ORF6感染的sf9昆虫细胞,经超薄切片电镜观察,可见重组杆状病毒呈多粒包埋,经间接免疫荧光、Western-blotting检测,CCV的ORF6蛋白可以在感染了AC-ORF6的sf9细胞中表达。研究表明,获得了插入ORF6基因的重组杆状病毒,并且该基因可以在重组杆状...

新加坡石斑鱼虹彩病毒(Singapore grouper iridovirus,SGIV)是导致石斑鱼养殖严重经济损失的主要病原体。本研究构建了含有新加坡石斑鱼虹彩病毒(Singapore grouper iridovirus,SGIV)ORF086基因的重组表达质粒载体pET32a-ORF086,将其转化到大肠杆菌中进行融合表达,经SDS-PAGE分析和Western blot鉴定,证实重组大肠杆菌融合表达了SGIV ORF086蛋白。经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isoprophl-thio-β-D-galactopyranoside,IPTG)浓度、诱导温度、诱导时间等诱导表达条件的优...

本研究对编码牡蛎疱疹病毒(Ostreid herpesvirus 1,OsHV-1)囊膜蛋白的orf111基因进行了生物信息学分析、克隆和表达。首先,通过特异性PCR扩增得到orf111基因全长序列,并对其编码囊膜蛋白的理化性质、高级结构、跨膜区和抗原决定簇等进行生物信息学分析。结果显示,orf111编码一种稳定的疏水性蛋白,具有5个跨膜结构域和9个抗原决定簇,同时,氨基酸序列中还包含1个高度保守的精氨酰-甘氨酰-天冬氨酸(Arg-Gly-Asp, RGD)结构域。随后,构建了pET28a-orf111重组质粒,并将其转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞中。最后,通过使用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导蛋白表达,表达产物分子量约为32 kDa。本研究应用原核表达得到了含RGD结构域的OsHV-1囊膜蛋白,为进一步制备ORF111蛋白单克隆抗体及开展牡蛎疱疹病毒侵染机制的研究奠定了重要基础,为将来OsHV-1的防控工作提供新的思路。

利用PCR方法扩增鲤疱疹病毒Ⅱ型(CyHV-2)ORF25基因的部分基因序列,并将扩增产物连接到原核表达载体pGEX-KG,成功构建了CyHV-2-ORF25-KG重组质粒。IPTG将其诱导后,SDS-PAGE分析表明:目的蛋白得到表达,分子质量大小为42ku,且主要以包涵体形式存在;用纯化的融合蛋白免疫BALB/c小鼠,多次免疫后通过细胞融合,筛选出1株单抗5C6;经间接免疫荧光试验和Western blot试验验证,这株单抗可以识别CyHV-2ORF25蛋白。

为了更好地研究对虾白斑综合征病毒(WSSV)蛋白VP19在WSSV感染过程中的作用,利用VP19的单克隆抗体直接对VP19进行了定位。从患白斑综合征的中国明对虾(Fenneropenaeus chinensis)鳃丝中提取WSSV,将提纯的WSSV经十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离,然后洗脱提纯其病毒蛋白VP19并免疫Balb/c小鼠,取免疫小鼠脾细胞和骨髓瘤细胞融合,用间接免疫荧光技术(IFAT)和Western-Blot技术筛选出1株阳性杂交瘤细胞,将检测出的阳性杂交瘤细胞经有限稀释法克隆,研制出抗VP19的单抗,再利用免疫胶体金技术对病毒蛋白VP19进行定位,结...

【目的】构建溶藻弧菌外膜蛋白OmpK原核表达载体,优化OmpK蛋白的诱导表达条件,制备OmpK蛋白小鼠多克隆抗体。【方法】通过PCR扩增获得ompK基因,连接pET-32a质粒构建OmpK-pET32a载体,将其转化大肠杆菌BL21后进行诱导表达。利用切胶纯化获得OmpK蛋白后,免疫小鼠制备OmpK蛋白多克隆抗体,采用ELISA法检测抗体效价,Western-Blotting法检测抗血清特异性。通过正交试验,获得OmpK菌株的最佳诱导表达条件与培养条件。【结果】PCR扩增获得了长816bp的ompK基因;成功构建了OmpK-pET32a载体,其诱导表达产物分子质量为30ku,与预期结果一致。E...

用ＲＴ－ＰＣＲ从感染番茄环纹斑点病毒（ＴｏｍａＴｏ ｚｏｎａＴｅ ｓＰｏＴ ｖｉＲｕｓ，Ｔｚｓｖ）的番茄中扩增出编码病毒非结构蛋白ｎｓｓ基因，将ｎｓｓ基因构建到原核表达载体Ｐ ｅＴ－３０ ａ中，获得原核表达载体Ｐ ｅＴ－３０ａ－ｎｓｓ，转化大肠杆菌ＢＬ２１（Ｄｅ３），用ｉＰＴＧ诱导表达。ｓＤｓＰａＧｅ电泳分析显示，高效诱导表达了５７ｋ Ｄａ融合蛋白。用回收纯化的融合蛋白免疫家兔，获得多抗血清。间接ｅＬｉｓａ测定多抗血清的效价为１／８１９２。用制备好的抗血清对Ｔｚｓｖ感病病样进行ＷｅｓＴｅＲｎ ＢＬｏＴＴｉｎＧ检测，能检测到特异性条带。结果表明该抗血清可用于Ｔｚｓｖ的检测，并为进一步研究ｎｓｓ功．．．

用RT-PCR从感染番茄环纹斑点病毒(Tomato zonate spot virus,TZSV)的番茄中扩增出编码病毒非结构蛋白NSs基因,将NSs基因构建到原核表达载体p ET-30 a中,获得原核表达载体p ET-30a-NSs,转化大肠杆菌BL21(DE3),用IPTG诱导表达。SDSPAGE电泳分析显示,高效诱导表达了57k Da融合蛋白。用回收纯化的融合蛋白免疫家兔,获得多抗血清。间接ELISA测定多抗血清的效价为1/8192。用制备好的抗血清对TZSV感病病样进行Western blotting检测,能检测到特异性条带。结果表明该抗血清可用于TZSV的检测,并为进一步研究NSs功...

将鳗鲡疱疹病毒(AngHV)福建株(AngHV-FJ)ORF51基因克隆至原核表达载体pGEX-4T-2中,构建表达质粒pGEX-4T-2-ORF51,将其转化至表达菌株E.coli BL21(DE3)中,IPTG诱导后,收集表达菌体,进行SDS-PAGE分析和免疫印迹试验验证,结果表明,获得了高效表达的AngHV-FJ ORF51融合蛋白.经割胶回收纯化,获得高纯度的融合表达蛋白.用纯化的表达蛋白免疫新西兰大白兔,获得了高效价的兔抗ORF51多克隆抗体.这为进一步研究ORF51蛋白的结构和功能及开展AngHV病的防治研究提供了重要的研究基础.

以常规基因重组技术,将orf216基因克隆入含有内含肽标签的原核表达载体pTYB1中,得到重组质粒pTYB1-orf216,经鉴定正确后,转化至大肠杆菌ER2566感受态细胞,15℃下0.8 mmol/LIPTG诱导15 h后,SDS-PAGE检测到大小约85 ku的特异性蛋白条带,融合蛋白以可溶组分形式存在。融合蛋白经亲和纯化后制备多克隆抗体,Western blot分析表明多克隆抗体具有较高的特异性,可与免疫原特异结合。

选取鹅黄病毒囊膜蛋白(E蛋白)基因进行克隆、表达和纯化,以获得能应用于血清学诊断和可作为亚单位疫苗的重组蛋白。根据鹅黄病毒JS804株全基因序列设计了1对引物,采用RT-PCR方法扩增出了鹅黄病毒的E基因,将其克隆到表达载体pET32a(+)中,构建了重组表达质粒pET32a-E,转化大肠杆菌BL21(DE3),并用IPTG进行诱导表达。结果表明,鹅黄病毒E基因在大肠杆菌中获得高效表达,融合蛋白分子量约为70 kDa,主要以包涵体形式存在于菌体中。Western Blot和间接免疫荧光试验发现,重组E蛋白具有较好的反应原性和良好的免疫原性。鹅黄病毒E蛋白的原核表达为进一步研究该蛋白功能、建立血...

以本实验室保存的REV毒株为模板,采用RT_PCR技术扩增了REV env部分基因,长为939 bp,并进行亚克隆到pMD18_T质粒载体上,连接、转化、鉴定后得到阳性重组质粒pET_env,将目的片段进行序列分析,结果表明,该REV的env基因与已发表的SNV株、中国HA9901株以及A株同源性均达94%以上,推导的氨基酸同源性为94%以上。将该基因片段与原核表达载体pET_32a重组,并将重组质粒转化至宿主菌BL21中,用IPTG诱导表达,对表达的蛋白用SDS_PAGE电泳,免疫印迹和薄层凝胶扫描分析,表达产物与理论推理一致;免疫印迹结果证明,表达的env蛋白可被REV阳性血清所识别。

【背景】轮状病毒（Rotavirus,RV）是全球范围内幼儿和各种幼畜急性病毒性胃肠炎的主要原因之一，在公共卫生中具有重要意义。猪轮状病毒病是一种由猪轮状病毒（Porcine Rotavirus,PoRV）引起的一种急性肠道传染病，常造成仔猪消化道功能紊乱，引发严重的呕吐、腹泻和脱水症状，一旦爆发将对养猪业造成重大经济损失。目前，针对PoRV感染尚无特效药物治疗，疫苗接种是控制感染的最经济的途径。然而，PoRV基因型多且易变异，不同基因型之间的交叉保护很不理想。因此，亟需加强对PoRV的流行病学监测和致病机制研究，探索新型防控策略。【目的】利用大肠杆菌原核系统表达PoRV NSP2、NSP4和NSP5非结构蛋白并免疫家兔获得相应多克隆抗体，为PoRV的防控和致病机制研究提供技术手段。【方法】将PoRV的NSP2、NSP4和NSP5基因进行密码子优化后，克隆到pCold-sumo载体中。将测序正确的阳性重组质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)，经IPTG诱导获得重组蛋白。利用SDS-PAGE和Western blot鉴定蛋白表达情况。对重组蛋白进行亲和层析柱纯化和定量后，采用皮下多点注射方法接种新西兰大白兔，每隔14 d加强免疫一次，经过3次免疫后制备多克隆抗体。采用间接ELISA方法测定多克隆抗体的效价、间接免疫荧光（IFA）和Western blot验证多克隆抗体与PoRV的反应性。再通过Western blot进一步检测PoRV感染过程中3个非结构蛋白的动态表达，以及鉴定3个重组真核质粒转染的效果。【结果】NSP2、NSP4和NSP5重组菌能够有效表达目的蛋白，SDS-PAGE分析可在目标位置清晰观察到明显条带，并且目的蛋白以可溶性形式存在。3个重组蛋白制备的多克隆抗体，ELISA效价均超过1﹕81 000，表明重组蛋白免疫原性良好。IFA结果表明3个多克隆抗体均能够与优势流行基因型轮状病毒发生特异性反应，与其他常见腹泻病原无反应。Western blot结果也展示了研究制备的NSP4、NSP5多克隆抗体可用于病毒感染过程中非结构蛋白的动态表达以及真核质粒转染的鉴定。而NSP2多克隆抗体未能特异性识别到PoRV感染后的NSP2蛋白的表达，但特异性检测到NSP2重组质粒转染后的NSP2蛋白表达，这一结果可能与NSP2的表达特性有关，有待进一步研究确认。随后进行的真核质粒转染验证以及PoRV感染过程中非结构蛋白的动态表达检测结果也验证了本实验制备多克隆抗体的实用性。【结论】成功利用大肠杆菌表达了PoRV的NSP2、NSP4和NSP5非结构蛋白，并获得效价高、特异性良好的多克隆抗体，为PoRV致病机制研究和防控技术研发奠定基础。

【目的】构建重组兔出血症病毒(Rabbit hemorrhagic disease virus,RHDV)VPg(Viral Protein Ge-nome-Linked,VPg)蛋白基因的原核表达质粒,在大肠杆菌BL21(DE3)中表达和纯化VPg蛋白,制备多克隆抗体,并检测抗体的基本特性。【方法】用PCR方法扩增RHDVVPg基因,将其克隆至原核表达载体pET-30a(+)中,转化大肠杆菌BL21(DE3)菌株,用IPTG诱导,使之重组表达VPg蛋白,并用镍柱亲和层析法纯化重组蛋白。PCR扩增获得了345bp的VPg基因,用纯化的重组VPg蛋白免疫试验兔,制备抗VPg的多克隆抗体,用Wes...