用细菌学方法分离并初步鉴定文蛤内脏中的产气荚膜梭菌,PCR方法检测分离菌株的α、β、ε、ι、β2和肠毒素等产气荚膜梭菌毒素基因,PCR扩增片段克隆后进行核苷酸序列测定,然后与GenBank相应毒素基因的核苷酸序列进行同源性比较;分离菌株α毒素全长基因克隆、测序后与不同来源分离株进行同源性比较;检测内脏产气荚膜梭菌阳性的蛤肉组织中的α毒素基因以判定食品安全性。结果表明,文蛤内脏产气荚膜梭菌分离率为71%,69%的分离菌株为C型,31%的为A型,两种毒素型均能扩增出特异性β2条带及肠毒素条带,检出基因与GenBank相应毒素基因的同源性在98%以上;蛤肉组织α毒素基因检测结果为阴性。文蛤内脏分离菌...

为了探索一种快速、准确检测产气荚膜梭菌毒素型的方法,以便有效预防控制该病的流行和发生,利用SDS-PAGE方法,对通过ELISA鉴定的20株(A型16株、C型3株和D型1株)德国牛舍环境气源性产气荚膜梭菌分离株,以及通过Multiplex-PCR鉴定的57株山东省疫区产气荚膜梭菌分离株外毒素蛋白的相对分子质量进行测定,以确定毒素的种类,进而确定菌株的毒素型。结果表明,产气荚膜梭菌标准株、德国牛舍环境气源性产气荚膜梭菌分离株、山东省疫区产气荚膜梭菌分离株粗提外毒素的质量浓度分别为3.261,2.238~3.333,1.451~3.109mg/mL,精提外毒素的质量浓度分别为0.803,0.521...

【目的】建立产气荚膜梭菌β毒素抗体间接ＥＬＩＳＡ检测方法。【方法】将原核表达重组质粒ｐＥＴ－２８Ａ－β转化大肠杆菌ＢＬ２１（ＤＥ３）感受态细胞，用ＩｐＴＧ进行诱导表达，表达产物经镍柱亲和层析纯化、尿素梯度透析复性后进行ＷＥＳＴＥｒｎ ＢＬｏＴ鉴定。用复性的β毒素重组蛋白作为包被抗原，通过优化间接ＥＬＩＳＡ试验条件，建立其抗体间接ＥＬＩＳＡ检测方法，对该方法的特异性、敏感性和重复性进行考察，并用其对５２１份临床样本进行检测。【结果】通过诱导、纯化和复性，获得了纯度较高且具有良好反应原性的β毒素重组蛋白。间接ＥＬＩＳＡ条件为：抗原最佳包被质量浓度为５．０μＧ／ｍＬ，阳／阴性血清最佳稀释度为１∶５０．．．

【目的】获得产气荚膜梭菌ε毒素(ETX)的无毒重组突变体,并评价其毒力及免疫原性。【方法】对已知的D型产气荚膜梭菌ETX编码基因按照大肠杆菌偏爱密码子进行优化设计。同时,将第106位的组氨酸和第199位的苯丙氨酸分别突变为脯氨酸和谷氨酸,经人工合成,获得基因片段GETX_(m2)。将GETX_(m2)克隆至原核表达载体p ET30a-(+)后,将p ET30a-GETX_(m2)转化至BL21(DE3)感受态细胞中,在15℃和37℃两种条件下分别用IPTG诱导16 h和4 h,超声破碎后收集上清和沉淀,采用SDS-PAGE和Western blot方法检测重组蛋白的表达情况及其可溶性。利用Ni-IDA亲和层析方法对可溶性表达的重组蛋白进行纯化,从而获得重组蛋白r ETX_(m2)。利用Western blot方法,检测r ETX_(m2)与D型产气荚膜梭菌ETX抗血清的反应性。将r ETX_(m2)用细胞维持液稀释至100及10μg·m L~(-1),检测其对犬肾细胞系(MDCK细胞)的毒力。分别用胰酶活化前和活化后的r ETX_(m2),以0.0625、0.625和6.25 mg·kg~(-1) 3个剂量尾静脉注射,检测r ETX_(m2)对小鼠的毒力。随后,将r ETX_(m2)与Montanide ISA 201佐剂混合乳化制备疫苗,取4只健康家兔,皮下免疫2次(间隔两周),100μg/只。同时,Montanide ISA 201佐剂与PBS混合液免疫组作为对照组。分别在一免后14 d以及二免后21 d,采血,分离血清,按照《中华人民共和国兽药典》(2015年版)规定的方法检测血清对D型产气荚膜梭菌毒素的中和抗体效价。同时,在二免后21 d,对家兔经耳缘静脉注射1个家兔MLD的D型产气荚膜梭菌毒素,检测r ETX_(m2)对家兔的免疫保护效果。【结果】在15℃和37℃条件,r ETX_(m2)在BL21(DE3)菌体中均以可溶性和包涵体两种形式表达,综合考虑重组蛋白的表达量、可溶性及诱导时间,选择纯化在37℃条件下诱导获得的可溶性r ETX_(m2)。灰度扫描结果显示,在37℃诱导条件下,r ETX_(m2)可溶表达比例达30%;Western blot检测结果表明,D型产气荚膜梭菌毒素抗血清能够特异性的识别r ETX_(m2),出现特异性反应条带。MDCK细胞毒性实验显示,在r ETX_(m2)浓度为100μg·m L~(-1)的细胞培养基中孵育24 h后,细胞未出现细胞病变,而2 000倍稀释的D型产气荚膜梭菌天然毒素细胞培养基孵育组的细胞出现了明显的细胞病变;小鼠安全试验显示,尾静脉注射6.25 mg·kg~(-1)剂量的r ETX_(m2),对小鼠无致死性;血清中和试验结果显示,r ETX_(m2)免疫组每毫升的一免兔抗血清可中和450—750个小鼠MLD,每毫升的二免兔抗血清可中和2 500—4 000个小鼠MLD的D型产气荚膜梭菌毒素,而对照组的兔抗血清对D型产气荚膜梭菌毒素无中和作用;用1个家兔MLD的D型产气荚膜梭菌毒素攻毒后,对照组家兔4/4死亡,免疫组家兔4/4保护。【结论】产气荚膜梭菌r ETX_(m2)毒力基本丧失,但保留了良好的免疫原性,是D型产气荚膜梭菌病基因工程亚单位疫苗的理想候选抗原蛋白。

【目的】检测陕西关中地区肉品中的产气荚膜梭菌，并进行血清型和产气荚膜梭菌肠毒素（ＣＰＥ）基因型鉴定，初步掌握该地区肉品中产气荚膜梭菌的污染状况。【方法】从陕西西安、杨凌、武功等地的超市、农贸市场、肉食品小摊随机采集新鲜生熟鸡、猪肉及其制品，共计３１４份，经细菌分离纯化、染色镜检、生化试验和单重ＰＣＲ检测确定分离菌株为产气荚膜梭菌，应用多重ＰＣＲ检测分离菌株的血清型并进行ＣＰＥ毒素基因检测。【结果】样品中产气荚膜梭菌检出率为４５．８６％，且均为Ａ型ＣＰＥ产气荚膜梭菌，其中熟肉制品、生鲜肉检出率分别为５０．９１％和４３．１４％；鸡肉、猪肉检出率分别为５３．０６％和３３．９０％。【结论】陕西关中地区．．．

【目的】检测肉品中的产气荚膜梭菌，并进行血清型和产气荚膜梭菌肠毒素（ＣＰＥ）基因型鉴定，初步掌握陕西关中地区肉品中产气荚膜梭菌的污染状况。【方法】从陕西的西安、杨凌、武功等地的超市、农贸市场、肉食品小摊随机采集新鲜生熟鸡、猪肉及其制品，共计３１４份，经细菌分离纯化、染色镜检、生化试验和单重ＰＣＲ检测确定分离菌株为产气荚膜梭菌，应用多重ＰＣＲ检测分离菌株的血清型并进行ＣＰＥ毒素基因检测。【结果】样品中产气荚膜梭菌检出率为４５．８６％，且均为Ａ型ＣＰＥ产气荚膜梭菌，其中熟肉制品、生鲜肉检出率分别为５０．９１％和４３．１４％；鸡肉、猪肉检出率分别为５３．０６％和３３．９０％。【结论】陕西关中地区的肉．．．

为确定2018年7—11月西藏那曲牦牛发病的死亡原因,以安多县、班戈县、聂荣县和色尼区的26头病死牦牛内脏组织为研究对象,利用常规细菌培养法和特异性基因PCR方法,对分离菌进行鉴定,并对其荚膜血清类型、毒力基因以及致病性进行研究。结果表明:纯化得到13株分离菌,分离菌的菌落特征、菌体形态、生化鉴定结果均与多杀巴氏杆菌相符,并扩增出多杀巴氏杆菌特异性基因Kmt-1和16S rDNA,菌株Pm-1和Pm-2的Kmt-1基因序列与印度、伊朗、巴基斯坦、俄罗斯的牛源多杀巴氏杆菌的同源性均达98%以上;13株菌的荚膜分型鉴定结果均为B型;对分离菌进行已知的23种毒力基因检测结果显示,此次分离到的13株菌毒力基因的数量在16～19种,ptfA、fimA等16种毒力基因检出率为100%,tadD、toxA等4种毒力基因检出率为0,且每个地区分离株毒力基因的分布相同;致病性试验中对照组小鼠全部存活,处理组小鼠死亡时间为24～72 h,死亡率为100%,病变主要表现为脾脏、肺脏、肝脏、心脏出血坏死。导致此次那曲地区牦牛发病死亡的原因为荚膜B型多杀巴氏杆菌病,本研究可为该病的防治提供依据,也为下一步预防疫苗的研究提供了优势菌株。

【目的】检测奶牛源金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)新疆分离株生物被膜、肠毒素基因分布与毒力,分析其内在联系。【方法】采用微量滴定板测定法(MPA)、PCR方法和寇氏改良法分别测定164株S.aureus新疆分离株生物被膜(BF)形成能力、肠毒素基因分布、小鼠半数致死量(LD_(50))和脏器载菌量,观察其病理组织学变化。【结果】164株S.aureus BF阳性率为83.4%,以弱BF(BF~+)菌株为主;肠毒素基因检出率为96.3%,传统肠毒素see和新型肠毒素seg检出率最高,分别为57.3%和81.1%;强BF菌株(BF~(3+))LD_(50)要高于弱BF菌株(BF~+)和阴性菌株(BF~-),但其脏器载菌量低于BF~-菌株(P<0.05)。【结论】奶牛源S.aureus新疆分离株BF阳性菌株所占比例较高,其肠毒素基因携带率也较高。毒力研究表明,S.aureus分离株BF~(3+)菌株脏器载菌量低于BF~-菌株(P<0.05),且随着BF形成能力的增强毒力相应减弱。

粘附素(aha1)、气溶素(aerA)和细胞兴奋性肠毒素(alt)是气单胞菌的主要毒力因子。根据aha1、aerA和alt基因序列设计三对引物建立了可同时检测三种毒力基因的多重PCR方法(MPCR)。该方法扩增出气单胞菌的aha1大小为1087bp,aerA为721bp,alt为480bp,其敏感度为102CFU·mL-1。而对金黄色葡萄球菌、恶臭假单胞菌、拟态弧菌以及非致病性气单胞菌均未扩增出任何条带。用限制性内切酶EcoRⅤ、BamHⅠ和FbaⅠ分别酶切PCR扩增产物,均获得与预期一致的酶切图谱。用建立的MPCR对15株水生动物源气单胞菌安徽分离株进行毒力基因检测,结果显示在13株致病性气...

从福建东山县附近海域捕获3尾野生星点东方鲀(Takifugu niphobles),采用液相色谱-串联质谱法检测了其组织及从组织分离到的细菌发酵产物的河鲀毒素(Tetrodotoxin,TTX)含量,结果显示星点东方鲀卵巢、肝脏和肌肉组织的TTX含量分别是56.247、0.380和0.118μg/g。根据16S r DNA测序的结果,从星点东方鲀的肠道中分离到一株鳗利斯顿氏菌属(Listonella sp.)细菌,从肝脏中分离到两种不动杆菌属(Acinetobacter sp.)细菌,从肌肉中分离到一株肠

本研究旨在研制一种以紧密素为检测靶标的间接ＥＬＩＳＡ技术，检测血清中产志贺毒素大肠杆菌（ＳｈＩｇＡ ｔｏｘＩｇＥｎＩｃ ＥＳｃｈＥｒＩｃｈＩＡ ｃｏＬＩ，ＳｔＥｃ）的抗体水平。根据紧密素２７个亚型的ｎ端保守序列，体外表达３９０～５４３ ＡＡ片段制备包被抗原，通过敏感性、特异性、重复性和稳定性实验，建立检测ＳｔＥｃ的抗体的间接ＥＩＩＳＡ方法。经优化筛选的间接ＥＬＩＳＡ最佳反应条件：抗原包被浓度３ ｎｇ／孔，待检血清稀释比例１∶２００，ｈｒＰ－兔抗羊Ｉｇ ｇ、ｈｒＰ－兔抗牛Ｉｇ ｇ的工作浓度均为１∶１５０００，５％脱脂奶封闭Ｌ ｈ，底物作用时间１０ｍＩｎ，用于牛、羊疫苗抗体检测或者ＳｔＥｃ大肠杆菌．．．

采用超纳滤技术浓缩家兔产气荚膜梭菌(A)型疫苗,建立家兔产气荚膜梭菌(A)型疫苗浓缩工艺。配制家兔产气荚膜梭菌(A)型超纳滤浓缩疫苗,并对其无菌性、安全性和免疫效力进行了检验。结果显示,该工艺可将家兔产气荚膜梭菌(A)型灭活抗原浓缩约7倍,超纳滤膜用NaOH洗后其通量可以恢复;配制的家兔产气荚膜梭菌(A)型超纳滤浓缩疫苗无菌检验合格,安全检验家兔无不良反应,符合动物用生物制品要求;以2 mL/只的剂量免疫家兔,家兔产气荚膜梭菌(A)型超纳滤浓缩疫苗的保护率达100%,传统铝胶疫苗对照组的保护率平均为86.7%,表明超纳滤浓缩疫苗免疫效力优于传统铝胶疫苗。确定了家兔产气荚膜梭菌病(A)型疫苗超纳...

弧菌病(vibriosis)是我国南方沿海地区养殖真鲷(Pagrus major)中经常发生的主要细菌性疾病,该病的暴发性流行给整个真鲷养殖业造成了巨大的经济损失。在明确其病原菌是最小弧菌(Vibrio mimicus)基础上,对该菌的致病机理进行了深入的研究,并取得了重要的进展。已经证明真鲷弧菌病真正的致病因子是最小弧菌在致病的过程中产生的一种外毒素,这种毒素是单一多肽,不具备典型的细菌毒素的A、B亚基结构,不耐热,具有溶血性、细胞毒性和动物致死性等多种生物学活性,该外毒素性质独特,是最小弧菌产生的一类新的毒力因子,作者将这种毒素命名为Vm - Pm毒素。为

旨在获得C型产气荚膜梭菌性腹泻仔猪血清炎症因子含量、脾脏病理变化及转录组表达谱特征，为其防治提供参考。选择健康状况良好、体质量相近的7日龄二元仔猪6头，随机分为2组，即对照组(CS)和处理组(TS)。TS组每头仔猪每天灌服1 mL菌液(1×10~9 cfu/mL),连续5 d, CS组仔猪灌服不含菌液的培养液，感染后0,1,3,5 d采集血液分离血清，用ELISA方法检测IL-8、IFN-α和IFN-γ含量。试验结束后屠宰仔猪采集脾脏，进行HE染色和RNA-Seq测序，对测序获得的差异表达基因进行GO功能和KEGG信号通路富集分析，并采用RT-qPCR检测仔猪感染C型产气荚膜梭菌过程中关键差异表达基因的表达量。结果表明：TS组仔猪脾脏出现明显炎症，中性粒细胞浸润，伴有变性及坏死的实质细胞；第3,5天CS组血清中IL-8、IFN-α和IFN-γ含量极显著低于(P<0.01)TS组；TS组与CS组间有1 079个差异表达基因，上调583个，下调496个；差异表达基因富集的GO功能主要有细胞对β干扰素的反应、细胞对DNA损伤刺激的反应、炎症反应的负调控等，富集的KEGG信号通路主要有肺结核、乙型肝炎、B细胞受体等；抵抗C型产气荚膜梭菌感染的候选基因(如JAK3、TLR3、ILF2、CXXC1等)RNA-Seq结果与RT-qPCR结果一致。以上结果表明，JAK3、TLR3等基因通过关键信号通路可能在仔猪脾脏抵抗C型产气荚膜梭菌感染过程中发挥了重要功能。

为明确牙鲆及大菱鲆病原迟钝爱德华菌毒力基因的携带情况并建立分子检测方法,实验以迟钝爱德华菌fimA、fimB、gadB及citC为靶基因设计特异性引物,进行PCR扩增及环介导恒温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP),并对其特异性、灵敏性和实际应用进行了比较。结果显示,10株病原迟钝爱德华菌均扩增出fimA、fimB、gadB及citC 4种毒力基因,目的条带大小分别为240、217、171及119 bp,4株对照菌无任何扩增条带;以fimA和gadB设计的两对引物进行的双重PCR扩增,同一PCR反应体系中病原迟钝爱德华菌可扩增出240和...