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[期刊] 中国农业大学学报
[作者]
赵学亮 孙柯 苏倩 呼和巴特尔 王文龙
为探究捻转血矛线虫GST基因的原核表达及其生物信息学特征,以捻转血矛线虫cDNA为模板,设计特异性引物扩增GST基因,构建原核表达载体pET30a(+)-GST转化至E.coil BL21(DE3)感受态细胞,将鉴定正确的重组菌进行表达条件优化后,再通过SDS-PAGE分析蛋白表达的特征,并利用在线软件对GST蛋白进行生物信息学分析。结果表明:捻转血矛线虫GST基因大小为618 bp;诱导后的pET30a(+)-GST重组菌最佳诱导条件为0.05 mmol/L的IPTG在37℃时诱导6 h,以包涵体的形式存在,大小约为29 ku。生物信息学分析表明:GST分子式为C_(1083)H_(1657)N_(277)O_(294)S_6,属于不含信号肽和跨膜区的亲水性蛋白;二级结构主要由α螺旋形成;潜在的抗原表位主要位于25～48、55～63、92～106、113～124、139～147、170～189和195～205位氨基酸附近。本试验成功构建GST基因原核表达系统,优化表达条件下能稳定纯化GST重组蛋白,为进一步探索捻转血矛线虫丙硫咪唑耐药机制及GST蛋白的生物学特性提供研究基础。
[期刊] 中国农业大学学报
[作者]
寇慧林 陈昕迪 王腾宇 高娃 温海峰 张艳敏 于宇 李峥 刘春霞 王文龙
为分析捻转血矛线虫伊维菌素敏感虫株与耐药虫株之间差异表达的circRNAs在调控耐药性中的作用，本研究以捻转血矛线虫敏感虫株和耐药虫株为研究对象，采用Illumina Hiseq 2 000平台进行高通量测序及cDNA文库的构建，利用相关生物信息学软件对测得的circRNAs进行差异性分析，同时对来源基因进行GO和KEGG pathway功能富集。运用TargetScan和Miranda软件预测关键circRNAs靶向的miRNAs，探究circRNAs-miRNAs的作用。随后又随机选取5个显著差异的circRNAs，进行RT-qPCR检测并与转录组测序结果进行一致性评定。结果显示：1）敏感虫株与耐药虫株共筛选出677个差异表达的circRNAs，其中47个显著差异，23个显著上调，24个显著下调。2）所有差异circRNAs的来源基因GO富集分析显示，共富集到生物过程336个、细胞组分59个和分子功能110个，主要与代谢过程、细胞膜结构和催化活性等相关；KEGG富集分析显示，富集到257条通路，主要与代谢（脂肪酸生物合成、甘油磷脂代谢和丙酸代谢）、胰高血糖素信号通路和AMPK信号通路等相关。3)circRNAs-miRNAs调控网络分析显示，627个差异circRNAs靶向结合187个miRNAs，组成了10 602组调控关系。综上，本研究成功筛选了捻转血矛线虫伊维菌素敏感虫株和耐药虫株间差异表达的circRNAs，对所有差异circRNAs的来源基因进行功能注释和富集分析，并构建了部分显著差异circRNAs-miRNAs调控网络。本研究结果为捻转血矛线虫耐药性产生的分子机制研究提供了新思路。
[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
马春晓 张振超 李祥瑞 徐立新 宋小凯 严若峰
根据捻转血矛线虫精氨酸激酶(arginine kinase,AK)基因序列设计1对特异性引物进行RT-PCR,将得到的片段克隆到pMD19-T载体后进行序列测定和分析;将该基因的开放阅读框克隆到pET-32a(+)载体中,获得原核表达质粒pET32/AK并转化大肠杆菌BL21;重组子用IPTG诱导后用SDS-PAGE分析其表达情况;对重组蛋白变性、纯化后用梯度尿素对其进行连续透析复性,对复性后的重组蛋白用定磷法进行精氨酸激酶活性分析。结果表明从捻转血矛线虫总RNA中扩增出大小约为1 104 bp的DNA片段。该基因与GenBank中捻转血矛线虫AK基因的相似性为89%。SDS-PAGE电泳结果...
[期刊] 华北农学报
[作者]
雷海英 白凤麟 刘建霞 王志军
为研究玉米Ｚｍｃｅｎ基因的特征及生物学功能，并对其编码蛋白结构与功能进行分析。以玉米ｃ ＤｎＡ为模板，将其构建到带有ＧＳＴ表达标签的原核表达载体ｐ ＧｅＸ－６ｐ－１中，构建的重组载体ｐ ＧｅＸ－６ｐ－Ｚｍｃｅｎ转化至大肠杆菌ＢＬ２１（Ｄｅ３），通过０．３ ｍｍｏＬ／Ｌ ＩｐＴＧ在２７℃下诱导表达２０ ｈ，获得了可溶性的ＧＳＴ融合蛋白。采用ＧＳＴ亲和层析柱对重组蛋白进行纯化，经１２％ＳＤＳ－ｐＡＧｅ电泳和ＧＳＴ标签抗体ＷｅＳＴｅｒｎ ＢＬｏＴＴＩｎＧ检测，鉴定为含有ＧＳＴ－ＴＡＧ的融合蛋白，纯化的蛋白经ｐｒｅ ＳｃＩＳＳＩｏｎ ｐｒｏＴｅＡＳｅ（ｐｐＡＳｅ）过夜酶切切除ＧＳＴ标签，得到较纯的Ｚｍ．．．
[期刊] 华北农学报
[作者]
闫尊强 计亚楠 王鹏飞 张博 石海霞 滚双宝
旨在对合作猪StAR基因CDS区进行克隆及生物信息学分析，采用RT-qPCR方法检测StAR基因在不同组织中的表达量，以揭示其功能。结果发现，合作猪StAR基因CDS区长858 bp,编码285个氨基酸，与猪参考序列相比，第572位点处的A突变为G,导致第191位的赖氨酸突变成精氨酸，为错义突变，第791位点处插入1个碱基C,后续的20个氨基酸发生改变，导致移码突变；蛋白分子量90.95 ku,理论等电点8.87;消光系数33 835,不稳定系数41.49;含1个N-糖基化位点，二级结构主要由α螺旋和无规则卷曲构成，二级结构与三级结构基本一致；合作猪与猪、绵羊和黄牛StAR基因核苷酸序列相似性分别为99.77%,90.45%,91.78%;进化树结果显示，合作猪与猪亲缘关系最近，表明StAR基因编码序列具有种属特异性；StAR蛋白是不稳定的亲水性蛋白，无信号肽和跨膜区；StAR基因在脾、肾、肺等组织中均有表达，睾丸表达量较高，表明可能与合作猪睾丸发育有关。
[期刊] 华北农学报
[作者]
贺望兴 李文金 蒋咏梅 童忠飞 陈华玲 李延升 谢小群 李琛
为通过电子克隆得到灵芝LaeA基因序列，分析其基因序列信息，并初步探究其调控功能。采用电子克隆的方法，以已知桔青霉的LaeA蛋白序列为模板，在灵芝的EST数据库中进行序列相似性搜索比对(Blast),经序列拼接、序列验证和序列延伸等电子克隆方法获得灵芝LaeA基因的cDNA序列；采用生物信息学软件对LaeA基因编码蛋白质的基本理化性质、疏水性/亲水性、亚细胞定位、信号肽、二级结构、三级结构及进化关系等方面进行了预测和分析。结果表明，LaeA基因全长1 134 bp,编码378个氨基酸，蛋白分子质量为42.895 3 ku,存在于细胞质中，是亲水性蛋白；LaeA蛋白结构主要由47.88%无规则卷曲、33.33%α-螺旋和18.78%延伸链组成，有S-腺苷甲硫氨酸结合位点，属于AdoMet＿MTases超家族蛋白；系统进化分析结果显示，LaeA蛋白与云芝、污叉丝孔菌等白腐担子菌类的亲缘关系较为亲近；qRT-PCR结果表明，LaeA基因在灵芝细胞液体静置培养过程中的表达量显著高于振荡培养方式。推测LaeA蛋白作为1种甲基转移酶蛋白，通过参与组蛋白的甲基化修饰，进而影响基因簇的表达水平。
关键词：
灵芝 LaeA 电子克隆 生物信息学
[期刊] 华北农学报
[作者]
胡廷章 吴应梅 陈再刚 黄小云
半定量RT-PCR分析表明,水稻胚胎发育后期丰富蛋白基因OsLEA19a在水稻幼苗中的表达受干旱和高盐的诱导,说明OsLEA19a可能在水稻抗旱和抗盐中发挥作用。利用RT-PCR方法成功从水稻中克隆了OsLEA19a的cDNA。生物信息学分析表明,OsLEA19a基因编码一个由200个氨基酸残基组成的蛋白,蛋白分子量为20.48 kDa,等电点为5.89。OsLEA19a蛋白的5～48位氨基酸残基形成LEA_4结构域。OsLEA19a蛋白的二级结构有3个α-螺旋构象区域,没有伸展的β-片层构象,为亲水蛋白。进化树分析表明,OsLEA19a与单子叶植物第3组LEA蛋白的亲缘关系较近,而与双子叶植...
[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
张志凯 徐立新 宋小凯 李祥瑞 严若峰
根据Caruorhabditis elegans、C.briggsae和Brugia malayi的her-1基因的保守序列设计引物,从捻转血矛线虫cDNA中扩增出597 bp的DNA片段。以此序列为基础,通过5'RACE和3'RACE技术分别获得该基因的5'端和3'端未知序列。将这些序列拼接后获得捻转血矛线虫Hcher-1基因的全长cDNA,该基因全长1 091 bp,包含一个960 bp的最大开放阅读框(ORF)、67 bp 5'非翻译区和64 bp 3'非翻译区。根据该基因的ORF设计1对特异性引物,以捻转血矛线虫的总RNA为模板,采用RT-PCR技术,扩增出960 bp的DNA片段,序...
[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
严若峰 闫峰宾 王晶晶 徐立新 宋小凯 李祥瑞
根据秀丽新杆线虫等其他几种线虫的肌动蛋白(Actin)开放阅读框(ORF)设计简并引物,以捻转血矛线虫总RNA为模板,合成cDNA,用RT-PCR方法扩增出约为1 100 bp的DNA片段。将该片段克隆到T载体后进行序列测定和分析,结果表明该基因的ORF为1 131 bp,与秀丽新杆线虫、新杆状线虫、肿孔古柏线虫等的同源性高达86%以上,推导出其蛋白质序列含有376个氨基酸,与胎生网尾线虫、秀丽新杆线虫、新杆状线虫、马来丝虫等的肌动蛋白相似性均为98%以上,说明成功克隆了捻转血矛线虫actin基因。将捻转血矛线虫肌动蛋白基因的ORF克隆到pET-28a(+)中,构建了原核表达载体,用IPTG进...
[期刊] 华北农学报
[作者]
王青云 王润青 方聪燕 侯佩 苏亮 李建平 宋梅芳 杨建平 李雪梅 吴大付
为克隆水稻蛋白磷酸酶6(PP6)催化亚基基因OsPP6C,并构建该基因的过表达载体以及进行生物信息学分析。采用RT-PCR技术从水稻中花11叶片cDNA中扩增OsPP6C基因全长,并构建与GUS融合的pBI121-OsPP6CGUS表达载体。通过生物信息学方法分析了OsPP6C蛋白的理化性质、与拟南芥AtPP6C(即AtFyPP)之间的同源性以及不同物种间的系统发育关系,此外,对OsPP6C基因的启动子进行了顺式作用元件分析。结果表明,该基因转录序列包含一个912 bp的开放阅读框,编码303个氨基酸残基,蛋白的分子量约为3.47 kDa,等电点为5.13;具有疏水性,但不存在信号肽,属于非分...
[期刊] 华北农学报
[作者]
孙斌 唐琳 张军芳 孙建富 崔岩 王英 王恩泽 李强 李香子
旨在克隆延边牛UCP1(Uncoupling protein-1)CDS区序列,利用RT-PCR技术和基因克隆获得延边牛UCP1基因,与其他物种进行同源性比对及构建系统进化树,利用生物信息学方法预测UCP1编码蛋白质的理化性质、潜在的磷酸化位点等性质,利用实时荧光定量PCR(Quantitative Real-time PCR,qPCR)方法检测UCP1基因在延边牛不同组织的表达丰度。结果显示,延边牛UCP1基因的CDS区全长749 bp,编码249个氨基酸。同源性比对发现延边牛UCP1基因与印度牛同源性为99.47%,系统进化树表明,延边牛与印度牛的亲缘关系最近和南美羊驼亲缘关系最远。UCP1蛋白缺乏稳定性,脂溶系数是91.53,网状红细胞于体外的半衰期是30 h,总平均亲水性等于0.212,预测其具一定亲水性。二级结构由α-螺旋(54.03%)、延伸链(12.90%)、无规卷曲(27.42%)和β-转角(5.65%)所构成的混合型蛋白。磷酸化位点和糖基化位点分析结果表明,UCP1共有21个磷酸位点,4个潜在的O-糖基化位点,3个N-糖基化潜在位点。UCP1基因的编码产物无跨膜螺旋(TMHs)结构,跨膜螺旋氨基酸残基数量的预测值19.008 57,蛋白质前60个氨基酸的跨膜螺旋数预测值为10.980 09,位于膜细胞质侧的总概率22.995%且属于非分泌蛋白。经实时荧光定量PCR(RT-PCR)可知,延边牛脂肪与小肠内UCP1基因表达水平相对较高,而在肌肉、心脏中的表达水平较低。该试验结果可为进一步研究该基因的功能提供借鉴。
[期刊] 华北农学报
[作者]
张永淋 高彬 周杰 朱树华
为了深入研究2-Cys Prx基因调控桃果实氧化还原信号分子作用机制,结合了PCR技术和RT-PCR技术通过体外克隆的方法得到桃果实2-Cys Prx基因,通过对序列分析表明,2-Cys Prx基因全长1 424 bp,其中,编码区813 bp,共编码270个氨基酸。对其分子结构进行分析,2-Cys Prx蛋白分子量为29.7 ku,为疏水型蛋白,且是膜外蛋白。在线软件预测2-Cys Prx蛋白分子式为C1342H2110N348O403S4,分子量29.696 ku,由4 207个原子组成,理论等电点为6.23。使用Prot Scale分析该蛋白疏水性平均值为-0.126,说明2-Cys Prx为亲水性蛋白。TMHMM对跨膜结构进行预测,发现,2-Cys Prx氨基酸序列中不存在跨膜结构域,为膜外蛋白。此外,对该蛋白二级结构进行预测,发现2-Cys Prx有4个α螺旋结构、9个β折叠结构及无规则卷曲构成。系统进化树分析表明,肥城桃果实2-Cys Prx与其他植物氨基酸序列有较高同源性,其中与樱桃的亲缘关系最近,相似度达到了98.15%,表明植物体内2-Cys Prx具有较高的保守性。体外构建重组蛋白p ET-30a-2-Cys Prx成功在大肠杆菌BL21中表达,为下一步研究其功能与结构,从而探讨2-Cys Prx基因调控桃果实氧化还原信号作用机理奠定了基础。
[期刊] 西南农业学报
[作者]
包斌武 任倩倩 王晋鹏 李彦霞 冯芬 罗仍卓么 王兴平
【目的】旨在进行牛钙调蛋白依赖性蛋白激酶4（Calmodulin-dependent protein kinase 4，CAMK4）基因编码区（Coding sequence，CDS）的克隆、CAMK4蛋白的功能预测分析及CAMK4基因在西门塔尔牛各组织中的组织表达谱分析。【方法】采用RT-PCR结合测序技术获得牛CAMK4基因的CDS区，利用PortParam、ProtScale、SOPMA和DNAMAN等生物信息学在线工具进行CAMK4基因及其所编码蛋白质的序列分析，并利用qRT-PCR检测CAMK4基因在西门塔尔牛的心、肝、脾、肺、肾、肌肉和睾丸组织中的表达量。【结果】牛CAMK4基因CDS区的长度为801 bp，编码一条266个氨基酸组成的不稳定且无跨膜结构域的亲水的酸性蛋白质。牛CAMK4蛋白存在丝氨酸（Ser）、苏氨酸（Thr）和酪氨酸（Tyr）残基的19个磷酸化位点，主要在细胞质中发挥作用。该蛋白质含有1个蛋白激酶C超家族（PKc＿like superfamily）结构域和1个尿嘧啶DNA糖基化酶（PHA03201）结构域，同时，蛋白互作网络预测发现CAMK4蛋白可能与HDAC5、HDAC4、CAMKK1、CALM、CREB1、CALM2、PLCG2、CAMKK2、CALML3和CALML5蛋白有相互作用。CAMK4基因在西门塔尔牛睾丸组织中的表达量极显著高于心、肝、脾、肺、肾和肌肉组织。结合生物信息学分析结果，提示CAMK4基因可能参与调控细胞周期和免疫反应，并在精子发生及运动、精原干细胞自我更新等生物学过程发挥重要作用。【结论】本研究为进一步揭示牛CAMK4基因的功能和促进高繁殖力肉牛分子育种技术的研发提供基础资料。
[期刊] 华北农学报
[作者]
付言峰 李兰 王学敏 李碧侠 方晓敏 赵芳 任守文
脂肪肥胖相关基因(FTO)在控制食欲和能量消耗方面具有重要作用。为进一步了解猪FTO基因的结构和功能,以苏钟猪为试验对象,利用RT-PCR方法,分析该基因在苏钟猪5种不同组织(肺脏、肝脏、心脏、背膘和背最长肌)RNA水平的表达谱信息;对苏钟猪FTO基因的编码序列(CDS)进行了克隆测序,并用生物信息学方法分析了苏钟猪FTO蛋白的结构和不同物种间的同源性。结果表明,FTO基因在苏钟猪各组织中的mRNA表达丰度表现为:背膘>心脏>肺脏>肝脏>背最长肌,其中背膘中的表达量显著高于其他组织(P<0.05)。苏钟猪FTO的CDS区发现了8个SNPs,分别为G52A、C523T、G628A、A655G、A...
[期刊] 沈阳农业大学学报
[作者]
林景卫 关山越 钟鸣 陈丽静 李浩戈 张丽 范文丽 李天来
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