目的]本文旨在探讨捻转血矛线虫苏氨酸醛缩酶结构域包含蛋白(TA-1)体外对山羊外周血单个核细胞(PBMC)功能的影响。[方法]根据TA-1基因序列设计引物进行PCR,将所得目的片段克隆到pMD19-T载体进行测序和分析;将该片段亚克隆到pET-32a(+)载体中构建表达质粒pE T-32a/TA-1。重组子用IPTG诱导后用SDS-PAGE观察其表达情况,对重组蛋白(rT A-1)纯化、连续浓度梯度递减的尿素溶液透析复性。从健康山羊采集的血液分离获得的PBMC与rT A-1(10μg·mL(-1))共孵育

根据秀丽新杆线虫等其他几种线虫的肌动蛋白(Actin)开放阅读框(ORF)设计简并引物,以捻转血矛线虫总RNA为模板,合成cDNA,用RT-PCR方法扩增出约为1 100 bp的DNA片段。将该片段克隆到T载体后进行序列测定和分析,结果表明该基因的ORF为1 131 bp,与秀丽新杆线虫、新杆状线虫、肿孔古柏线虫等的同源性高达86%以上,推导出其蛋白质序列含有376个氨基酸,与胎生网尾线虫、秀丽新杆线虫、新杆状线虫、马来丝虫等的肌动蛋白相似性均为98%以上,说明成功克隆了捻转血矛线虫actin基因。将捻转血矛线虫肌动蛋白基因的ORF克隆到pET-28a(+)中,构建了原核表达载体,用IPTG进...

采用基因文库筛选方法,克隆了鲤外周血白细胞蛋白酶体激活因子PA28βcDNA,对其序列进行了分析,同时利用半定量反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)方法检测了不同外界因子刺激下鲤外周血白细胞PA28β的表达情况。结果显示,用DD-RTPCR的方法获得差异显示片段A18,经地高辛标记作为探针对有丝分裂原刺激的鲤外周血白细胞cDNA文库进行核酸杂交筛选,从0.8×104个重组噬菌体中,经过两轮筛选获得阳性克隆。序列分析表明,该阳性克隆长1175bp,含有一个大小为735bp编码244个氨基酸的完整开放阅读框,为编码鲤鱼蛋白酶体激活因子PA28β的全长cDNA。系统发生分析其与已报道的斑马鱼蛋白酶体...

根据捻转血矛线虫精氨酸激酶(arginine kinase,AK)基因序列设计1对特异性引物进行RT-PCR,将得到的片段克隆到pMD19-T载体后进行序列测定和分析;将该基因的开放阅读框克隆到pET-32a(+)载体中,获得原核表达质粒pET32/AK并转化大肠杆菌BL21;重组子用IPTG诱导后用SDS-PAGE分析其表达情况;对重组蛋白变性、纯化后用梯度尿素对其进行连续透析复性,对复性后的重组蛋白用定磷法进行精氨酸激酶活性分析。结果表明从捻转血矛线虫总RNA中扩增出大小约为1 104 bp的DNA片段。该基因与GenBank中捻转血矛线虫AK基因的相似性为89%。SDS-PAGE电泳结果...

【目的】捻转血矛线虫(Haemonchus contortus)是反刍动物主要的胃肠道线虫之一,该病在中国呈全国性流行。为研究捻转血矛线虫(Haemonchus contortus)脂肪酸代谢相关蛋白DAF-22的生化特性,对其基因进行了克隆、原核表达,并对重组蛋白进行了体外酶活性测定。以期了解捻转血矛线虫Hc-DAF-22蛋白在过氧化物酶体脂肪酸β氧化中的作用。【方法】根据NCBI公布的H.contortus ZJ株daf-22 cDNA序列(Gen Bank:HQ738470.1)设计特异性引物,克隆

【目的】捻转血矛线虫(Haemonchus contortus)寄生在牛羊等反刍动物的皱胃中,引起的捻转血矛线虫病在我国呈全国性流行。文章通过研究脂肪酸与视黄醇结合相关蛋白Hc-FAR-4的表达特性及配体结合能力,以了解其在捻转血矛线虫生长、发育、繁殖过程中的作用。【方法】对Hc-far-4进行克隆、并且构建原核表达载体p ET-30a-Hc-far-4,p ET-30a-Hc-far-4重组质粒经过PCR与双酶切鉴定准确无误之后转化到E. coli BL21感受态细胞中,用0.1 mmol·L~(-1) IPTG(isopropyl-β-d-thiogalactoside)进行重组蛋白的诱导表达。收集重组蛋白r Hc-FAR-4,利用荧光分析法,研究r Hc-FAR-4蛋白与DAUDA、视黄醇、油酸的结合能力。配体结合试验是依据荧光物质retinol与脂肪酸类似物DAUDA在极性和非极性溶液中,在某一波长的激发光激发下,所发出的荧光光谱随之变化的特性,判断r Hc-FAR-4蛋白是否具有与DAUDA、retinol结合的能力。再在体系中加入非荧光长链脂肪酸油酸,根据荧光光谱的变化情况判定油酸能否分别与DAUDA、retinol竞争目的蛋白的脂肪酸结合位点,间接说明目的蛋白能否与非荧光脂肪酸油酸结合。同时制备鼠源多克隆抗体,利用ELISA技术检验免疫后小鼠的抗体效价,抗体效价合适即可收集小鼠血清。收集的血清用于免疫组织荧光(IHF)试验,探究Hc-FAR-4的表达部位,从而推测其功能。该试验过程为:对捻转血矛线虫进行石蜡包埋,石蜡切片,抗原修复,3%的BSA于4℃封闭过夜,自制鼠源多克隆抗体作为一抗孵育1 h; Alexa Fluor?488 nm羊抗鼠Ig G作为二抗避光孵育1 h,DAPI染色30 min,激光共聚焦显微镜检查染色情况。利用荧光定量PCR技术分析Hc-far-4在捻转血矛线虫各个主要阶段的表达特性。【结果】成功克隆目的基因Hc-far-4,测序结果与Sanger数据库中捻转血矛线虫far-4基因序列(>HCISE00908800.t1)相似度为99.9%;重组质粒p ET-30a-Hc-far-4在E. coli BL21中成功表达,在诱导8 h后达到峰值。经过ELISA检测,结果显示制备的鼠源多克隆抗体效价达到1﹕1 024 000—1﹕2 048 000,可用于后续试验。Western Blot鉴定结果显示r Hc-FAR-4重组蛋白带有His标签,并且条带大小为25 k D,结果符合预期。制备的鼠源多克隆抗体经过Western Blot鉴定,能够与天然Hc-FAR-4蛋白结合,说明该抗体可用于IHF试验。配体结合试验结果表明r Hc-FAR-4蛋白具有结合脂肪酸与视黄醇的能力。荧光定量PCR分析表明,Hc-far-4在四期幼虫中的转录水平最高;IHF试验表明,Hc-FAR-4主要表达在捻转血矛线虫的肠壁、性腺中。综上推测Hc-FAR-4蛋白主要在寄生生活阶段参与了转运脂肪酸与视黄醇,为捻转血矛线虫的生长发育与生殖提供营养物质。【结论】捻转血矛线虫FAR-4蛋白能够结合脂肪酸类似物DAUDA和视黄醇,但是与油酸的结合能力较弱,主要表达在肠壁,在性腺、角皮中也有少量表达,其基因在进行营寄生生活阶段时表达量达到峰值。

【目的】以体外试验观察雌雄捻转血矛线虫半乳糖凝集素重组蛋白(rHco-gal-m/f)对山羊外周血单核细胞多种细胞因子mRNA转录水平的影响及其量效关系。【方法】选用2岁健康山羊5只,分别从颈静脉无菌采血,分离外周血单核细胞(PBMCs),以ConA或LPS刺激的同时分别加入0μg·ml-1,10μg·ml-1、20μg·ml-1和40μg·ml-1的rHco-gal-m/f,进行体外培养。用RT-PCR方法,以肌动蛋白基因(β-actin)作内标,定量分析单核淋巴细胞白介素-1β(IL-1β)、白介素-2(IL-2)、白介素-4(IL-4)、白介素-6(IL-6)、干扰素-γ(IFN-γ)和...

【目的】原核表达奶山羊表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)蛋白胞外区25-644位共620个氨基酸序列(ECD序列),纯化蛋白并免疫家兔,制备针对山羊EGFR蛋白的特异性多克隆抗体,为山羊EGFR蛋白功能研究奠定基础。【方法】以pMD19-T-EGFR为模板,采用PCR方法扩增得到EGFR胞外区(ECD)基因序列。将ECD序列连接pET-32a(+)质粒构建pET-32a(+)-ECD原核表达载体,将该重组载体导入大肠杆菌BL21(DE3)中并诱导

捻转血矛线虫是世界各国危害牛、羊等反刍动物的主要寄生虫之一.目前虽然有特效的化学药物驱虫,但因其具一定的副作用,寄生虫易产生耐药性,药物易在内品残留,危害人类健康.苏云金芽胞杆菌是一种革兰氏阳性细菌,它在形成芽胞的同时,在菌体一端形成一种蛋白性质伴胞晶体,它对昆虫有较高毒力,对人畜安全无毒,不污染环境,成本低,已广泛用于防治农、林、仓贮害虫和医学

【目的】检测重组雌、雄捻转血矛线虫半乳糖结合凝集素(rHco-GAL-f/m)免疫山羊皱胃转录细胞因子。【方法】用rHco-GAL-f/m免疫山羊,通过原位杂交法对阴性对照组(A)、攻虫对照组(B)、免疫攻虫组(C)和免疫不攻虫组(D)山羊皱胃中白介素-1β(IL-1β)、白介素-2(IL-2)、白介素-4(IL-4)、白介素-6(IL-6)、干扰素-γ(IFN-γ)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)mRNA转录进行定位,并对上述细胞因子阳性反应细胞数量进行分析。【结果】A组山羊皱胃组织中没有检测到细胞因子,其它3组仅在皱胃黏膜下层中检测到了上述细胞因子。B、C和D组间IL-4和IL-6阳性反应...

为探究捻转血矛线虫GST基因的原核表达及其生物信息学特征,以捻转血矛线虫cDNA为模板,设计特异性引物扩增GST基因,构建原核表达载体pET30a(+)-GST转化至E.coil BL21(DE3)感受态细胞,将鉴定正确的重组菌进行表达条件优化后,再通过SDS-PAGE分析蛋白表达的特征,并利用在线软件对GST蛋白进行生物信息学分析。结果表明:捻转血矛线虫GST基因大小为618 bp;诱导后的pET30a(+)-GST重组菌最佳诱导条件为0.05 mmol/L的IPTG在37℃时诱导6 h,以包涵体的形式存在,大小约为29 ku。生物信息学分析表明:GST分子式为C_(1083)H_(1657)N_(277)O_(294)S_6,属于不含信号肽和跨膜区的亲水性蛋白;二级结构主要由α螺旋形成;潜在的抗原表位主要位于25～48、55～63、92～106、113～124、139～147、170～189和195～205位氨基酸附近。本试验成功构建GST基因原核表达系统,优化表达条件下能稳定纯化GST重组蛋白,为进一步探索捻转血矛线虫丙硫咪唑耐药机制及GST蛋白的生物学特性提供研究基础。

为了克隆黏虫丝氨酸蛋白酶的全基因序列，并进行原核表达，以黏虫为研究对象，利用RT-PCR扩增丝氨酸蛋白酶的部分基因，进而通过RACE技术，得到丝氨酸蛋白酶全基因，通过Blast等软件对获得基因序列和推导的蛋白质序列进行分析，并利用大肠杆菌表达系统对其进行表达。结果表明，成功克隆黏虫丝氨酸蛋白酶全基因，将其命名为MsPG,序列全长2 010 bp,开放阅读框为1 593 bp,编码530个氨基酸，蛋白质分子质量为67.6 ku,等电点为7.63,且具有含6个半胱氨酸的clip结构域，推测其为clip型丝氨酸蛋白酶。MsPG氨基酸序列与其他鳞翅目昆虫序列一致性在70.00%～91.92%,其中与烟芽夜蛾(GenBank登录号：PCG78401.1)序列一致性最高，达到91.92%。成功构建重组质粒pET30a(+)-MsPG,其在大肠杆菌原核表达系统中0.1 mmol/L IPTG诱导下的最佳表达温度是25℃。综上，黏虫丝氨酸蛋白酶MsPG具有丝氨酸蛋白酶家族保守的功能位点，且能够在体外进行原核表达。

含溴结构域蛋白(bromodomain/BRD-containing protein, BCP)是一种高度保守的蛋白,属于含溴结构域和额外终端域(bromodomain and extraterminal, BET)蛋白超家族成员。该蛋白在有丝分裂过程中通过募集不同的染色体修饰蛋白,达到了广泛调控基因复制及转录的作用,其表达水平的变化常与肿瘤及炎症的发生相关联。本研究根据实验室前期转录组结果提示信息,首次获得了凡纳滨对虾2 229 bp的BCP基因cDNA序列(LvBRD, GenBank注册号:MH638256),利用在线软件进行了生物信息学分析,利用实时荧光定量PCR (qPCR)技术分析了该基因的组织表达特征和其在对虾白斑综合征病毒(WSSV)、苏云金芽孢杆菌以及副溶血性弧菌侵染过程中的表达变化特征。结果显示,LvBRD编码的蛋白质有一个保守的可以参与细胞周期调控过程的溴结构域(bromodomain,BRD);组织表达分析表明该基因主要在凡纳滨对虾血细胞、肝胰腺和鳃组织中表达;在WSSV和病原菌感染后早期(0.5～12 hours past infection,hpi),Lv-BRD的表达可以被显著诱导,在血细胞中呈明显上调的表达趋势,表明该基因在一定程度上参与了对虾体内由病原引发的天然免疫应答反应。上述研究结果为进一步研究Lv-BRD基因在对虾抗病毒免疫及干扰素调控过程中的功能和作用机制奠定了基础。

为探讨类猪圆环病毒2型因子P1感染对猪抗病毒蛋白分子mRNA转录的影响,将P1分子克隆接种30日龄健康广西巴马小型猪,利用实时荧光定量PCR技术对猪外周血单个核细胞抗病毒蛋白分子PKR、2'-5'OAS2、 RNase L和Mx1的mRNA转录水平的变化进行了定量分析。结果表明,PKR mRNA转录在接种后8 d和40 d呈上调趋势;而2'-5'OAS2 mRNA在3 d和17 d下调,Mx1 mRNA也在接种后17 d下调;RNaseL mRNA转录水平则没有发生明显变化。研究揭示P1感染猪后,机体的抗病毒蛋白的功能受到了不同程度的影响。

根据Caruorhabditis elegans、C.briggsae和Brugia malayi的her-1基因的保守序列设计引物,从捻转血矛线虫cDNA中扩增出597 bp的DNA片段。以此序列为基础,通过5'RACE和3'RACE技术分别获得该基因的5'端和3'端未知序列。将这些序列拼接后获得捻转血矛线虫Hcher-1基因的全长cDNA,该基因全长1 091 bp,包含一个960 bp的最大开放阅读框(ORF)、67 bp 5'非翻译区和64 bp 3'非翻译区。根据该基因的ORF设计1对特异性引物,以捻转血矛线虫的总RNA为模板,采用RT-PCR技术,扩增出960 bp的DNA片段,序...