为分析捻转血矛线虫伊维菌素敏感虫株与耐药虫株之间差异表达的circRNAs在调控耐药性中的作用，本研究以捻转血矛线虫敏感虫株和耐药虫株为研究对象，采用Illumina Hiseq 2 000平台进行高通量测序及cDNA文库的构建，利用相关生物信息学软件对测得的circRNAs进行差异性分析，同时对来源基因进行GO和KEGG pathway功能富集。运用TargetScan和Miranda软件预测关键circRNAs靶向的miRNAs，探究circRNAs-miRNAs的作用。随后又随机选取5个显著差异的circRNAs，进行RT-qPCR检测并与转录组测序结果进行一致性评定。结果显示：1）敏感虫株与耐药虫株共筛选出677个差异表达的circRNAs，其中47个显著差异，23个显著上调，24个显著下调。2）所有差异circRNAs的来源基因GO富集分析显示，共富集到生物过程336个、细胞组分59个和分子功能110个，主要与代谢过程、细胞膜结构和催化活性等相关；KEGG富集分析显示，富集到257条通路，主要与代谢（脂肪酸生物合成、甘油磷脂代谢和丙酸代谢）、胰高血糖素信号通路和AMPK信号通路等相关。3)circRNAs-miRNAs调控网络分析显示，627个差异circRNAs靶向结合187个miRNAs，组成了10 602组调控关系。综上，本研究成功筛选了捻转血矛线虫伊维菌素敏感虫株和耐药虫株间差异表达的circRNAs，对所有差异circRNAs的来源基因进行功能注释和富集分析，并构建了部分显著差异circRNAs-miRNAs调控网络。本研究结果为捻转血矛线虫耐药性产生的分子机制研究提供了新思路。

为探究捻转血矛线虫GST基因的原核表达及其生物信息学特征,以捻转血矛线虫cDNA为模板,设计特异性引物扩增GST基因,构建原核表达载体pET30a(+)-GST转化至E.coil BL21(DE3)感受态细胞,将鉴定正确的重组菌进行表达条件优化后,再通过SDS-PAGE分析蛋白表达的特征,并利用在线软件对GST蛋白进行生物信息学分析。结果表明:捻转血矛线虫GST基因大小为618 bp;诱导后的pET30a(+)-GST重组菌最佳诱导条件为0.05 mmol/L的IPTG在37℃时诱导6 h,以包涵体的形式存在,大小约为29 ku。生物信息学分析表明:GST分子式为C_(1083)H_(1657)N_(277)O_(294)S_6,属于不含信号肽和跨膜区的亲水性蛋白;二级结构主要由α螺旋形成;潜在的抗原表位主要位于25～48、55～63、92～106、113～124、139～147、170～189和195～205位氨基酸附近。本试验成功构建GST基因原核表达系统,优化表达条件下能稳定纯化GST重组蛋白,为进一步探索捻转血矛线虫丙硫咪唑耐药机制及GST蛋白的生物学特性提供研究基础。

为明确捻转血矛线虫（Haemonchus contortus）中Kunitz型蛋白BLI-5的表达特性，利用生物信息学软件对其基因结构、保守结构域、进化关系和蛋白质三维结构进行分析；基于WormBase数据库，分析捻转血矛线虫发育过程各个阶段Hc-bli-5与Hc-bli-4的相对转录丰度；通过构建原核表达载体诱导表达重组蛋白，并制备多克隆抗体，采用虫体组织免疫荧光试验分析目标蛋白（Hc-BLI-5）在捻转血矛线虫中的组织定位情况。结果显示：1)Hc-bli-5基因全长2 088 bp，由4个外显子和3个内含子组成，Hc-BLI-5共有195个氨基酸，132～192位氨基酸为Kunitztype super family结构域，是一种丝氨酸蛋白酶抑制因子。2）进化树分析发现，丝氨酸枯草杆菌蛋白酶超家族蛋白BLI-5在寄生线虫和自由生活线虫中均有较为密切的进化关系，捻转血矛线虫与柏氏血矛线虫（Haemonchus placei）在该基因的进化关系上最为接近，聚集在进化树的同一小分支上。3）蛋白质结构对比分析显示，捻转血矛线虫和秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）BLI-5具有一定的相似性，尤其是Kunitz结构域。4）各时期转录丰度检测显示，Hc-bli-5与Hc-bli-4的表达趋势有一定的重叠，提示二者可能互相作用、参与共同的生物学过程。5）组织定位研究表明，Hc-BLI-5蛋白主要表达于捻转血矛线虫的表皮和肌肉组织。综上，Hc-bli-5可能与Hc-bli-4相互作用参与捻转血矛线虫蜕皮过程。本研究明确了Hc-bli-5的序列特征及其蛋白的表达特性，为探索其是否参与捻转血矛线虫蜕皮过程及其作用机制提供了理论依据。

根据捻转血矛线虫精氨酸激酶(arginine kinase,AK)基因序列设计1对特异性引物进行RT-PCR,将得到的片段克隆到pMD19-T载体后进行序列测定和分析;将该基因的开放阅读框克隆到pET-32a(+)载体中,获得原核表达质粒pET32/AK并转化大肠杆菌BL21;重组子用IPTG诱导后用SDS-PAGE分析其表达情况;对重组蛋白变性、纯化后用梯度尿素对其进行连续透析复性,对复性后的重组蛋白用定磷法进行精氨酸激酶活性分析。结果表明从捻转血矛线虫总RNA中扩增出大小约为1 104 bp的DNA片段。该基因与GenBank中捻转血矛线虫AK基因的相似性为89%。SDS-PAGE电泳结果...

【目的】捻转血矛线虫(Haemonchus contortus)寄生在牛羊等反刍动物的皱胃中,引起的捻转血矛线虫病在我国呈全国性流行。文章通过研究脂肪酸与视黄醇结合相关蛋白Hc-FAR-4的表达特性及配体结合能力,以了解其在捻转血矛线虫生长、发育、繁殖过程中的作用。【方法】对Hc-far-4进行克隆、并且构建原核表达载体p ET-30a-Hc-far-4,p ET-30a-Hc-far-4重组质粒经过PCR与双酶切鉴定准确无误之后转化到E. coli BL21感受态细胞中,用0.1 mmol·L~(-1) IPTG(isopropyl-β-d-thiogalactoside)进行重组蛋白的诱导表达。收集重组蛋白r Hc-FAR-4,利用荧光分析法,研究r Hc-FAR-4蛋白与DAUDA、视黄醇、油酸的结合能力。配体结合试验是依据荧光物质retinol与脂肪酸类似物DAUDA在极性和非极性溶液中,在某一波长的激发光激发下,所发出的荧光光谱随之变化的特性,判断r Hc-FAR-4蛋白是否具有与DAUDA、retinol结合的能力。再在体系中加入非荧光长链脂肪酸油酸,根据荧光光谱的变化情况判定油酸能否分别与DAUDA、retinol竞争目的蛋白的脂肪酸结合位点,间接说明目的蛋白能否与非荧光脂肪酸油酸结合。同时制备鼠源多克隆抗体,利用ELISA技术检验免疫后小鼠的抗体效价,抗体效价合适即可收集小鼠血清。收集的血清用于免疫组织荧光(IHF)试验,探究Hc-FAR-4的表达部位,从而推测其功能。该试验过程为:对捻转血矛线虫进行石蜡包埋,石蜡切片,抗原修复,3%的BSA于4℃封闭过夜,自制鼠源多克隆抗体作为一抗孵育1 h; Alexa Fluor?488 nm羊抗鼠Ig G作为二抗避光孵育1 h,DAPI染色30 min,激光共聚焦显微镜检查染色情况。利用荧光定量PCR技术分析Hc-far-4在捻转血矛线虫各个主要阶段的表达特性。【结果】成功克隆目的基因Hc-far-4,测序结果与Sanger数据库中捻转血矛线虫far-4基因序列(>HCISE00908800.t1)相似度为99.9%;重组质粒p ET-30a-Hc-far-4在E. coli BL21中成功表达,在诱导8 h后达到峰值。经过ELISA检测,结果显示制备的鼠源多克隆抗体效价达到1﹕1 024 000—1﹕2 048 000,可用于后续试验。Western Blot鉴定结果显示r Hc-FAR-4重组蛋白带有His标签,并且条带大小为25 k D,结果符合预期。制备的鼠源多克隆抗体经过Western Blot鉴定,能够与天然Hc-FAR-4蛋白结合,说明该抗体可用于IHF试验。配体结合试验结果表明r Hc-FAR-4蛋白具有结合脂肪酸与视黄醇的能力。荧光定量PCR分析表明,Hc-far-4在四期幼虫中的转录水平最高;IHF试验表明,Hc-FAR-4主要表达在捻转血矛线虫的肠壁、性腺中。综上推测Hc-FAR-4蛋白主要在寄生生活阶段参与了转运脂肪酸与视黄醇,为捻转血矛线虫的生长发育与生殖提供营养物质。【结论】捻转血矛线虫FAR-4蛋白能够结合脂肪酸类似物DAUDA和视黄醇,但是与油酸的结合能力较弱,主要表达在肠壁,在性腺、角皮中也有少量表达,其基因在进行营寄生生活阶段时表达量达到峰值。

根据Caruorhabditis elegans、C.briggsae和Brugia malayi的her-1基因的保守序列设计引物,从捻转血矛线虫cDNA中扩增出597 bp的DNA片段。以此序列为基础,通过5'RACE和3'RACE技术分别获得该基因的5'端和3'端未知序列。将这些序列拼接后获得捻转血矛线虫Hcher-1基因的全长cDNA,该基因全长1 091 bp,包含一个960 bp的最大开放阅读框(ORF)、67 bp 5'非翻译区和64 bp 3'非翻译区。根据该基因的ORF设计1对特异性引物,以捻转血矛线虫的总RNA为模板,采用RT-PCR技术,扩增出960 bp的DNA片段,序...

【目的】研究临床分离的大肠杆菌多重耐药株(R)与大肠杆菌标准株ATCC 25922(S)蛋白质差异表达情况,为进一步研究大肠杆菌耐药机理奠定基础。【方法】采用串联质谱标签(tandem mass tag,TMT)法结合平行反应监测(parallel reaction monitoring,PRM)技术,对大肠杆菌R和S株的全菌体蛋白进行定量蛋白质组学研究,筛选大肠杆菌多重耐药株(S)与敏感株(R)之间的差异表达蛋白,并对其生物信息学进行分析。【结果】共筛选出300个差异表达蛋白(Fold change≥1.3,P<0.05),其中上调167个,下调133个,涉及的耐药相关通路主要包括细菌趋药性、ABC转运蛋白、β-内酰胺抗性等;PRM成功定量到13个差异蛋白,且PRM验证结果与TMT定量结果一致。【结论】筛选出多个与大肠杆菌耐药性相关的差异表达蛋白和通路。

将捻转血矛线虫H11基因亚克隆到酵母表达载体pPICZαB后,用氯化锂法转化巴斯德毕赤酵母菌株X33,通过含ZeocineTM抗生素的YPD平板筛选出72个重组子。重组酵母用甲醇诱导后,经RTPCR、SDSPAGE和Westernblot检测,结果表明捻转血矛线虫H11在巴斯德毕赤酵母中实现了表达。

【目的】捻转血矛线虫(Haemonchus contortus)是反刍动物主要的胃肠道线虫之一,该病在中国呈全国性流行。为研究捻转血矛线虫(Haemonchus contortus)脂肪酸代谢相关蛋白DAF-22的生化特性,对其基因进行了克隆、原核表达,并对重组蛋白进行了体外酶活性测定。以期了解捻转血矛线虫Hc-DAF-22蛋白在过氧化物酶体脂肪酸β氧化中的作用。【方法】根据NCBI公布的H.contortus ZJ株daf-22 cDNA序列(Gen Bank:HQ738470.1)设计特异性引物,克隆

根据秀丽新杆线虫等其他几种线虫的肌动蛋白(Actin)开放阅读框(ORF)设计简并引物,以捻转血矛线虫总RNA为模板,合成cDNA,用RT-PCR方法扩增出约为1 100 bp的DNA片段。将该片段克隆到T载体后进行序列测定和分析,结果表明该基因的ORF为1 131 bp,与秀丽新杆线虫、新杆状线虫、肿孔古柏线虫等的同源性高达86%以上,推导出其蛋白质序列含有376个氨基酸,与胎生网尾线虫、秀丽新杆线虫、新杆状线虫、马来丝虫等的肌动蛋白相似性均为98%以上,说明成功克隆了捻转血矛线虫actin基因。将捻转血矛线虫肌动蛋白基因的ORF克隆到pET-28a(+)中,构建了原核表达载体,用IPTG进...

目的]本文旨在探讨捻转血矛线虫苏氨酸醛缩酶结构域包含蛋白(TA-1)体外对山羊外周血单个核细胞(PBMC)功能的影响。[方法]根据TA-1基因序列设计引物进行PCR,将所得目的片段克隆到pMD19-T载体进行测序和分析;将该片段亚克隆到pET-32a(+)载体中构建表达质粒pE T-32a/TA-1。重组子用IPTG诱导后用SDS-PAGE观察其表达情况,对重组蛋白(rT A-1)纯化、连续浓度梯度递减的尿素溶液透析复性。从健康山羊采集的血液分离获得的PBMC与rT A-1(10μg·mL(-1))共孵育

【目的】检测重组雌、雄捻转血矛线虫半乳糖结合凝集素(rHco-GAL-f/m)免疫山羊皱胃转录细胞因子。【方法】用rHco-GAL-f/m免疫山羊,通过原位杂交法对阴性对照组(A)、攻虫对照组(B)、免疫攻虫组(C)和免疫不攻虫组(D)山羊皱胃中白介素-1β(IL-1β)、白介素-2(IL-2)、白介素-4(IL-4)、白介素-6(IL-6)、干扰素-γ(IFN-γ)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)mRNA转录进行定位,并对上述细胞因子阳性反应细胞数量进行分析。【结果】A组山羊皱胃组织中没有检测到细胞因子,其它3组仅在皱胃黏膜下层中检测到了上述细胞因子。B、C和D组间IL-4和IL-6阳性反应...

利用GoenBank发表的捻转血矛线虫B微管蛋白葵因组DNA序列设计2对引物,建立检测捻转血矛线虫苯并咪哇类药物抗性的多重PcR方法,利用该方法检测我国不同地区捻转血矛线虫对苯并咪哇类药物的抗性,并用生物学检测验证,结果表明,建立的多重PCR方法在杭性检测上具有很强的特异性,澳大利亚抗性虫株只有F1和F3条带,上海敏感虫株只有F2和F3片段;序列分析证实抗性虫株编码B微管蛋白第200位氮墓酸的密码子为TAC,敏感虫株为TTC。并且该法具有很高的灵敏性,检测基因组DNA的最低量为50ng。生物学检测,澳大利亚杭性虫株丙硫苯咪哇LD_50ml,上海敏感虫株的LD50为0.0023,与多重PCR结果...

松材线虫取食和致病相关基因的鉴定是揭示松材线虫病致病机制的重要研究内容。以松材线虫混合虫体为测试方,线虫卵为驱动方,构建二者差减cDNA文库。文库测序结果经序列拼接、功能注释,共获得松材线虫虫体特异表达的有效EST序列354个,拼接后获得34个重叠群,其中15个重叠群获得明确的功能注释,其中MixC12、MixC25、MixC33分别与过氧化物酶、β-1,4内切葡聚糖酶、锌指家族蛋白有较高的同源性,这些基因被认为与植物线虫的取食和致病性密切相关。RT-PCR分析验证了所获得的差减cDNA的代表性。

【目的】构建捻转血矛线虫DNA疫苗,并研究该疫苗对山羊的免疫保护效果。【方法】将捻转血矛线虫重要保护性抗原H11的编码基因分H11-1、H11-2和H11-3三部分,分别亚克隆到基因疫苗载体pcDNA4/HisMaxC中,用酶切反应、序列测定等方法鉴定重组疫苗。将纯化的DNA疫苗肌肉注射山羊后,用RT-PCR、Westernblotting和ELISA方法检测疫苗在山羊体内的转录、翻译和诱导IgG的产生。第2次免疫后2W用10000条捻转血矛线虫第3期幼虫攻击实验动物,检测山羊虫卵排出、虫卵孵化率、成虫数量等免疫保护性指标。【结果】获得了捻转血矛线虫H11DNA疫苗,疫苗第1次免疫7d后在山羊...