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[期刊] 中国水产科学
[作者]
李小飞 李槿年 季晶晶 余为一
自行构建的pMD18T-OmpU重组克隆质粒经BamHI/EcoRI双酶切后,定向插入原核表达质粒pGEX-4T-1中构建重组表达质粒pGEX-4T-1-OmpU。将重组表达质粒转化至大肠杆菌E.coliBL21进行IPTG诱导表达。表达产物经SDS-PAGE电泳及Western-blot分析显示,以包涵体形式表达的GST-OmpU融合蛋白的分子量约为62.9kD,可与鼠抗拟态弧菌外膜蛋白(Omps)免疫血清发生特异性反应,提示重组OmpU保留了天然Omps的抗原性。用纯化的融合蛋白免疫昆明系小鼠,以50LD50拟态弧菌(5×108CFU/mL)攻击,小鼠的免疫保护率为60%(9/15)。表明...
[期刊] 淡水渔业
[作者]
郑宗林 郑曙明 Delbert M.Gatlin Ⅲ 汪开毓
为评价嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila,Ah)PDK06株外膜蛋白A(omp A)的原核表达产物是否具有抗原性及其对斑点叉尾(Ictalurus punctatus)的免疫保护力,根据Gen Bank上嗜水气单胞菌外膜蛋白omp A基因序列(Gen Bank登录号:AF146597)设计去信号肽引物,扩增获得一段约1 000 bp的序列,经鉴定正确后,构建重组表达质粒p ET-32a(+)-pomp A;然后将该质粒转入BL21(DE3)后用IPTG诱导表达,经纯化后得到pomp A重组蛋白;最后将pomp Aomp A蛋白与弗氏不完全佐剂(FIA)混合免疫斑点叉尾,评价...
[期刊] 淡水渔业
[作者]
郑宗林 郑曙明 Delbert M.Gatlin III 汪开毓
为评价嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila,Ah)PDK06株外膜蛋白A(ompA)的原核表达产物是否具有抗原性及其对斑点叉尾鮰(Ictalurus punctatus)的免疫保护力,根据GenBank上嗜水气单胞菌外膜蛋白ompA基因序列(GenBank登录号:AF146597)设计去信号肽引物,扩增获得一段约1000bp的序列,经鉴定正确后,构建重组表达质粒pET-32a(+)-pompA;然后将该质粒转入BL21(DE3)后用IPTG诱导表达,经纯化后得到pompA重组蛋白;最后将pompAompA蛋白与弗氏不完全佐剂(FIA)混合免疫斑点叉尾鮰,评价其免疫效果。结果显...
[期刊] 华中农业大学学报
[作者]
黄辉 毛芝娟 陈吉刚
根据已发表的哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)外膜蛋白OmpU的基因序列设计1对特异性引物,应用聚合酶链式反应(PCR)方法,自哈维氏弧菌致病菌株基因组中扩增获得一段约1 000 bp的序列,构建重组载体pMD18-T-OmpU;测序结果表明,该基因与已发表的哈维氏弧菌外膜蛋白OmpU序列存在98%以上的相似性,该序列在GenBank上的登录号为FJ919231。构建表达质粒pET-30a(+)-OmpU后转化至大肠杆菌E.coliBL21(DE3),在IPTG诱导下实现高效表达,SDS-PAGE显示重组蛋白分子质量约为41 ku,与预期基本相符。重组蛋白以包涵体形式表达。以脲素法得到...
[期刊] 华北农学报
[作者]
刘祥
对溶藻弧菌外膜蛋白ＯｍｐＵ进行分子克隆构建，抗原性生物信息学分析，为疫苗的开发奠定了基础。通过分子克隆获得ＯｍｐＵ蛋白的原核表达菌株，重组表达后利用切胶纯化获得ＯｍｐＵ蛋白，免疫小鼠制备抗血清，Ｗｅｓｔｅｒｎ ＢｌＯｔｔｉｎｇ检测发现ＯｍｐＵ蛋白具有很好的抗原性。采用在线软件预测ＯｍｐＵ为亲水的分泌型蛋白；存在多个酶切位点。采用ｔｍＨｍｍ ｓｅｒｖｅｒ ｖ．２．０程序预测ＯｍｐＵ无跨膜结构并定位于细胞膜外。通过ｓｉｇｎａｌ ｐ ４．１软件分析发现ＯｍｐＵ的１～２１位氨基酸为信号肽序列。ｓＯｐｍａ服务器预测ＯｍｐＵ的二级结构含无规则卷曲２７．９４％，α－螺旋为３３．２４％，β－转角为１０．２９％．．．
[期刊] 水产学报
[作者]
王莹 汪浩 徐伟 汪玮 施慧 王庚申 谢建军 何杰 许文军
为评价大黄鱼杀香鱼假单胞菌外膜蛋白Tol C（GenBank：EPB97112.1）的免疫保护效果，通过原核表达获得重组的Tol C功能域蛋白，命名为B6。用兔抗杀香鱼假单胞菌多抗血清对B6进行免疫原性的初步检测。将B6与明矾佐剂混合制成亚单位疫苗，腹腔注射免疫大黄鱼，免疫4周后攻毒，检测相对保护率（relative percent survival，RPS）；同时，采集免疫后第2、4、6、8周的鱼血清和头肾、脾脏，测定血清抗体效价和免疫相关基因的表达变化；采集健康和攻毒后个体的头肾和脾脏，制成石蜡切片，观察组织病理变化。结果表明，B6分子量为22 ku。Western blot结果显示，杀香鱼假单胞菌兔抗血清与B6具有强结合条带。接种B6亚单位疫苗4周后，RPS达72.22%。ELISA结果显示，免疫后第2周起，血清抗体效价显著升高，第4周时达到峰值（log2 8.65），随后略有下降，第8周时降至log2 6.98。RT-PCR结果表明，免疫后第2、4、6、8周，头肾和脾脏中免疫相关基因均有不同程度的表达上调，其中IL-1β和MHC Ⅰ α的上调幅度最大，头肾中分别达到93.33倍和77.02倍，脾脏中分别达到241.13倍和131.95倍。除CD8外，IgM、IL-1β、CD4、MHC Ⅰ α、MHC Ⅱ β在脾脏中的表达上调幅度均高于头肾。石蜡切片显示，PBS对照组在攻毒后头肾和脾脏中出现严重的出血点和结节，并伴随不同程度的铁黄素沉积，B6免疫组在头肾和脾脏中仅有少量出血点，无结节和铁黄素沉积。综上，本研究对大黄鱼杀香鱼假单胞菌外膜蛋白Tol C进行了原核表达和免疫保护效果评价，结果表明B6具有良好的免疫原性，免疫后4周RPS达72.22%，具有作为亚单位候选疫苗的潜力。
[期刊] 西南农业学报
[作者]
简思杰 晁嘉 孙薇 陈春琳 陆娟 刘勇 刘祥
【目的】旨在评价嗜水气单胞菌外膜蛋白AHA2991的免疫学功能，为探索嗜水气单胞菌渔用疫苗候选抗原提供理论依据。【方法】通过生物信息学分析AHA2991氨基酸序列，揭示不同菌株间的亲缘关系；分子克隆构建AHA2991表达菌株并确定最佳诱导条件；包涵体洗涤及SDS-PAGE切胶纯化获得AHA2991并免疫红鲫；Western blotting检测AHA2991红鲫血清的特异性与效价；ELISA模拟AHA2991红鲫血浆与嗜水气单胞菌的体外相互识别作用；酸性、碱性磷酸酶（ACP、AKP）测定与细胞吞噬作用评价AHA2991非特异性免疫功能；组织病理学切片探究AHA2991免疫对红鲫内脏的影响情况。【结果】AHA2991蛋白家族在不同菌株间具有同源性，不同菌株间亲缘关系较近，尤其在气单胞菌间亲缘关系更近；AHA2991的最佳诱导条件为：菌液浓度OD_(600) =1.0，IPTG终浓度0.1 mmol/L，在28 ℃下诱导8 h。红鲫AHA2991抗血清具有良好的特异性，其效价为1:800；体外AHA2991血浆对嗜水气单胞菌具有识别作用，滴度可达1:3 200；ACP、AKP指标及细胞吞噬作用均显示AHA2991激活红鲫非特异性免疫；组织病理学切片表明AHA2991免疫对红鲫内脏结构无影响。【结论】嗜水气单胞菌AHA2991具有良好的免疫原性，有望成为嗜水气单胞菌渔用疫苗的候选抗原成分。
[期刊] 水产学报
[作者]
黄浦江 黄郁葱 简纪常 吴灶和 鲁义善 张雪利
参照GenBank上登录的哈维氏弧菌外膜蛋白OmpW基因序列,设计引物扩增OmpW的开放阅读框,序列分析结果显示该基因全长645 bp。将其定向克隆到原核表达载体pET-32a(+),在大肠杆菌BL21中成功表达出带His-tag的融合蛋白,融合蛋白分子量约为43.8 ku,且主要以包涵体形式存在。优化的表达条件为37℃,IPTG浓度0.1 mmol/L,诱导时间5 h。将纯化的融合蛋白免疫SPF昆明小鼠制备多克隆抗体,ELISA方法检测抗体效价达1∶30 000,Western-blot结果表明鼠抗OmpW血清能与诱导后的重组蛋白发生特异反应,提示OmpW可能是哈维氏弧菌的一种重要保护性抗原...
[期刊] 水产学报
[作者]
张崇文 于涟 毛芝娟 褚武英 钱荣华
根据哈维氏弧菌外膜蛋白OmpK的基因序列设计一对引物,应用聚合酶链式反应(PCR)方法,从分离自患病大黄鱼的哈维氏弧菌基因组中扩增获得一段约800bp的序列。将其克隆到pGEMTeasy载体,测序结果证明该序列是哈维氏弧菌外膜蛋白OmpK基因。用PCR方法去除其信号肽序列,定向克隆到原核表达载体pGEX4T2构建重组表达质粒pGEX4TOmpK。IPTG诱导后能够在大肠杆菌BL21中高效表达分子量约为53kD的GSTOmpK融合蛋白。用纯化后的融合蛋白免疫新西兰兔获得了高效价的抗血清。Westernblotting分析表明,它与从哈维氏弧菌中提取的约27kD的外膜蛋白能够发生特异反应,提示外膜...
关键词：
哈维氏弧菌 外膜蛋白 OmpK 原核表达
[期刊] 水产学报
[作者]
黄志坚 何建国
利用初步制备的溶藻弧菌外膜蛋白(outer membrane protein ofVibrio alginolyticus,Va-OMP)、溶藻弧菌蛋白分子量58kD外膜蛋白(Va-OMP58)和溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus,Va)灭活菌苗、溶藻弧菌脂多糖(lipopolysaccharides ofVibrio alginolyticus,Va-LPS)菌苗等进行主动保护性和被动保护性的实验比较,Va-OMP、Va-OMP58免疫组小鼠免疫后用活菌攻击,免疫保护率为62.5%~86.7%,而Va-LPS组和Va灭活菌苗组的免疫保护率为50%~62.5%,对照组的免疫保护...
关键词：
溶藻弧菌 外膜蛋白 免疫原性 免疫保护性
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
陈春琳 刘祥 俱雄
【目的】构建溶藻弧菌外膜蛋白OmpK原核表达载体,优化OmpK蛋白的诱导表达条件,制备OmpK蛋白小鼠多克隆抗体。【方法】通过PCR扩增获得ompK基因,连接pET-32a质粒构建OmpK-pET32a载体,将其转化大肠杆菌BL21后进行诱导表达。利用切胶纯化获得OmpK蛋白后,免疫小鼠制备OmpK蛋白多克隆抗体,采用ELISA法检测抗体效价,Western-Blotting法检测抗血清特异性。通过正交试验,获得OmpK菌株的最佳诱导表达条件与培养条件。【结果】PCR扩增获得了长816bp的ompK基因;成功构建了OmpK-pET32a载体,其诱导表达产物分子质量为30ku,与预期结果一致。E...
[期刊] 西南农业学报
[作者]
刘祥
Ｏｍｐ Ｕ蛋白为溶藻弧菌主要外膜蛋白，具有很好的免疫原性，在疫苗上有很好的应用前景。本试验通过分子克隆获得Ｏｍｐ Ｕ蛋白的表达菌株，利用切胶纯化获得Ｏｍｐ Ｕ蛋白，免疫小鼠制备多克隆抗体，采用ＥＬＩＳＡ法检测抗体滴度为１∶３２００倍，ＷＥＳｔＥｒｎＢＬＯｔｔＩｎｇ法检测抗血清特异性较好。通过正交试验，获得Ｏｍｐ Ｕ菌株的最佳表达条件为：诱导时菌液ＯＤ６００值１，加Ｉｐｔｇ终浓度０．１ｍｍＯＬ／Ｌ，诱导时间８ ｈ，温度３２℃；最佳培养条件为：葡萄糖浓度０．４％，转速２３０ ｒ／ｍＩｎ，装液量５０ ｍ Ｌ。为Ｏｍｐ Ｕ工业发酵、蛋白功能与疫苗开发研究奠定基础。
[期刊] 水产学报
[作者]
李明云 丁文超 陈炯 史雨红
溶藻弧菌是中国南部水产养殖业中弧菌病的最主要病原菌,数量居海洋类弧菌之首,其快速检测具有重要意义。以溶藻弧菌国内标准株ATCC17749基因组DNA为模板,PCR扩增出外膜蛋白OmpK基因,将其克隆入表达载体pET-28a中,获得重组质粒pET-28a-OmpK,限制性内切酶结合琼脂糖凝胶电泳分析和序列测定结果表明,该序列开放读码框正确且与已发表的OmpK结构编码序列完全一致。将重组质粒pET-28a-OmpK转化大肠杆菌BL21pLysE,高效表达重组蛋白,将其纯化后免疫小鼠所得的高免血清能外膜蛋白OmpK特异性结合,表明体外表达的重组蛋白OmpK具有良好的免疫原性和反应原性。利用该抗溶藻弧...
[期刊] 中国水产科学
[作者]
毛芝娟 由振强 魏永伟 于涟
从浙江省象山港网箱养殖大黄鱼病鱼分离的一株副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)ZJ2003中克隆了两种铁调外膜蛋白psuA和pvuA的基因(GenBank登录号:DQ141607、DQ141608),经PCR的方法去除两基因的信号肽编码序列后亚克隆到原核表达载体pET30a(+)中,经IPTG诱导获得大量表达。表达的重组蛋白以包涵体形式存在。包涵体蛋白经尿素法纯化及梯度透析法复性后以100μg/尾的剂量免疫大黄鱼,4周后经活菌攻毒获得80%的免疫保护率。免疫印迹分析表明,人工感染存活鱼的血清可以识别此两种重组蛋白。研究结果显示该两种铁调外膜蛋白具有良好的免疫原性,有可能...
[期刊] 中国水产科学
[作者]
公衍军 陈吉祥 杜萌 李爱娟 李筠 张晓华
对已分离的1株致病性鳗弧菌W1外膜蛋白图谱进行SDS-PAGE分析,并与8株不同血清型的鳗弧菌外膜蛋白进行比较。结果表明,鳗弧菌W1主要外膜蛋白分别为24 kD,38 kD,42 kD和47 kD,主要外膜蛋白图谱与鳗弧菌O1血清型标准菌株VIB1相似。抗生素药敏试验表明该菌对氨苄青霉素、强力霉素、磺胺嘧啶等14种常用药物产生了抗性,只对新生霉素、呋喃妥因、利福平、新霉素等9种药物敏感。研究不同浓度的氨苄青霉素、强力霉素、磺胺嘧啶和庆大霉素对鳗弧菌外膜蛋白表达的影响。结果表明,氨苄青霉素、强力霉素和磺胺嘧啶明显地抑制鳗弧菌42 kD的主要外膜蛋白的表达,随着抗菌素浓度的增加,该外膜蛋白的表达量...
关键词：
鳗弧菌 耐药性 外膜蛋白 表达
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