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[期刊] 浙江农林大学学报
[作者]
周佳平 林新春 徐英武
SEPALLATA3(SEP3)属于花器官建成ABCE模型中的E类基因,为了揭示SEP3蛋白是如何形成多聚体的,以及多聚体与其生物学功能之间的联系,开展了拟南芥Arabidopsis thaliana AtSEP3蛋白质体外可溶性表达实验,构建了原核表达载体,并在大肠埃希菌Escherichia coli细胞中进行重组蛋白的诱导表达。从蛋白不同的结构域、诱导时间和诱导温度等方面对蛋白的可溶性表达进行了分析。最后以pET-15b为表达载体,大肠埃希菌表达菌株E.coli‘Rosetta’为宿主菌株,22℃诱导表达15 h,获得不同片段的AtSEP3可溶性蛋白。通过镍柱及分子层析色谱柱分离纯化,表...
[期刊] 华北农学报
[作者]
张小梅 韩念法 张美祥 李广录 范三红 郭蔼光
从经水杨酸处理的拟南芥开花期植株中获得cDNA,扩增得到Alpha-dioxygenase 1(DOX1)基因,进行原核表达、纯化和生物活性检测。利用原核表达载体pMAL-c4x在T7 Express CompetentE.coli和BL21(DE3)-RIPL codon+菌株中表达DOX1,经Amylose Resin亲和层析柱纯化。SDS-PAGE结果表明,重组融合蛋白在BL21(DE3)-RIPL codon+中的表达通过灰度值比较分析以可溶性为主,表达率约3.7%,纯化的DOX1纯度可达45%。愈创木酚法表明,可溶性重组蛋白不具有过氧化物酶活性;2,4-DNP法测试表明可溶性重组蛋白...
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
薄慧杰 卢长明 吴刚 武玉花 肖玲 白延红 陈耀锋
通过PCR扩增,从pCAMBIA1300-bar质粒中获得bar基因编码区全长,经酶切鉴定和测序后证实,bar基因分离成功。用BamH和Hind酶切,将bar基因与原核表达载体pET28a(+)连接,构建成重组质粒pET28bar。将重组质粒pET28 bar转化大肠杆菌菌株BL21(DE3)后,获得高效表达。SDS-PAGE电泳分析显示,目的蛋白主要以包涵体形式存在,蛋白质分子量约为27 ku。将包涵体离心、洗涤和纯化后,得到高纯度的目的蛋白。该蛋白可以替代植物外源蛋白进行转bar基因产品的食用安全性检测,也可用于转bar基因产品ELISA检测的抗体制备。
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
唐波 杜娟 杨力侠 王小海 吴海波 吴勇延 郭泽坤
【目的】构建一种可获得Sumo修饰蛋白的原核表达系统,为Sumo化修饰蛋白的批量制备奠定基础。【方法】用Trizol裂解法提取小鼠畸胎瘤细胞F9的总RNA,反转录成cDNA后PCR扩增获得Sumo1、Ubc9、Sae2和Sae1基因。将上述基因及相应载体酶切、连接后构建出重组质粒pACYC-Ubc9-Sumo1、pCDF-Sae2-Sae1。采用质粒转化-制备阳性克隆感受态细胞-质粒转化的方法获得pACYC-Ubc9-Sumo1和pCDF-Sae2-Sae1共表达的Su-mo化修饰的原核表达系统。以pGEX-GST-Sox2和pGEX-GST-Sox2K247R重组质粒为例,采用Western...
[期刊] 华北农学报
[作者]
谢玮怡 毕燕会 周志刚
为研究海带核基因组编码的nuc Cbb X蛋白的结构和功能,根据海带配子体核基因cbb X(Gen Bank登录号:NP_053838)设计含有酶切位点的引物,通过RT-PCR方法获得末端连接NdeⅠ、XhoⅠ酶切位点的完整ORF。序列保守性分析表明,预测的海带成熟nuc Cbb X蛋白序列含具有AAA+结构域、Walker-A和Walker-B ATP结合位点及ATP水解酶和Ru Bis Co活化酶活性相关位点。序列相似度分析表明,海带nuc Cbb X与其质体基因组编码的pt Cbb X和类球红细菌的Rs Cbb X蛋白氨基酸序列相似度均较低,分别为37.4%和36.8%,相比pt Cbb...
[期刊] 华北农学报
[作者]
雷其冬 孙旭东 徐慧妮
为进一步研究转录因子TCP4在植物生长发育过程中的调控作用和下游靶基因。利用生物信息学分析转录因子TCP4家族及其蛋白序列,扩增AtTCP4基因CDS序列、构建原核表达载体并诱导纯化获得蛋白,利用凝胶电泳迁移试验(EMSA)验证AtTCP4蛋白与拟南芥功能基因LOX2启动子区域的顺式作用元件结合。生物信息学分析表明,拟南芥TCP蛋白含有非典型的螺旋-环-螺旋(bHLH)结构域;系统进化树表明,AtTCP4属于Ⅱ类TCP蛋白;蛋白三级结构预测表明:转录因子TCP4可以形成同源或异源二聚体。特异性引物扩增获得AtTCP4基因的CDS序列,其开放阅读框(ORF)长为1 263 bp。构建原核表达载体pET-28a-AtTCP4并转化到Rosetta(DE3)感受态中,经IPTG诱导、纯化和Western Blot检测证明获得AtTCP4蛋白。EMSA试验验证AtTCP4蛋白能够结合到功能基因LOX2的顺式作用元件。转录因子TCP4结合功能基因LOX2启动子区域,影响植物激素茉莉酸的生物合成,调控植物的生长发育过程。
[期刊] 湖南农业大学学报(自然科学版)
[作者]
张磊 唐永凯 李红霞 徐逾鑫 李迎宾 俞菊华
为获得可溶的鲤鱼IL–17N重组蛋白,构建原核重组表达质粒GST–17N、SUMO–GST–17N和MBP–17N,确定IL–17N的最适促溶标签,并优化其诱导表达条件(诱导剂异丙基–β–D–硫代半乳糖苷(IPTG)的浓度、诱导时间和诱导温度)。结果:成功构建了鲤鱼IL–17N原核重组表达载体GST–17N、SUMO–GST–17N和MBP–17N;融合标签MBP、SUMO–GST和GST的促溶效果依次降低,SUMO–GST–17N、MBP–17N上清蛋白占总蛋白比例分别为47.4%、87.0%;MBP–17N的最佳表达条件为0.5 mmol/L IPTG,25℃诱导8～12 h;经过镍柱纯化,获得可溶MBP–17N蛋白,每克总菌约获得0.09 mg MBP–17N蛋白。
[期刊] 中国农业科学
[作者]
谭永安 肖留斌 孙洋 赵静 柏立新
【目的】克隆绿盲蝽超气门蛋白基因(ALUSP),获得原核表达的重组蛋白,为ALUSP的功能研究奠定基础,也为进一步解析绿盲蝽蜕皮及变态发育的机制提供理论依据。【方法】根据已知昆虫的USP基因序列设计简并引物,获得ALUSP的保守序列;再通过设计特异性引物,利用RACE方法,分别克隆ALUSP 5′及3′段序列,然后通过拼接获得ALUSP全长序列;应用生物信息学方法,对ALUSP基因序列特征及其所编码蛋白的特性进行分析,建立系统进化树;将含有ALUSP的T载体经EcoR I及Xho I双酶切,构建ALUSP原核表达载体pEGX6P1-ALUSP,将该表达载体分别在15、25、30和37℃条件下进...
关键词：
绿盲蝽 超气门蛋白 基因克隆 原核表达
[期刊] 海洋渔业
[作者]
朱欣云 丁少青 张哲 任建峰 濮家飞 贾亮 李伟明 张庆华
海七鳃鳗(Petromyzon marinus)是现存最古老的无颌类脊椎动物之一,对其重要免疫分子的研究在免疫系统的进化理论上有重要意义。细胞趋化因子CXCL8(又称白细胞介素-8,Interleukin 8)是最重要的趋化因子之一。为了研究海七鳃鳗CXCL8基因在天然免疫中的作用,以海七鳃鳗肝脏c DNA为模板,通过比对海七鳃鳗基因组信息设计引物,使用RT-PCR方法扩增得到PmCXCL8基因。随后构建原核表达载体pColdI-CXCL8,将载体转化至E.coli BL21和Rosetta(DE3)中进
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
张劲 郭霭光 丰美福
为了进一步在蛋白质水平对人白细胞抗原HLA-G进行分析,利用已经构建好的克隆质粒pGEM-T-HLA-G1,进一步构建了重组原核表达质粒pET28a-sHLA-G1。SDS-PAGE检测表明,重组蛋白sHLA-G1在大肠杆菌(E.coli)中得到稳定表达,原核表达的重组蛋白sHLA-G1主要以包涵体形式存在。包涵体蛋白经充分洗涤、尿素溶解后用钴离子树脂纯化,并用SDS-PAGE和Western印迹进行了分析,鉴定结果表明,该蛋白纯度达到90%以上,并能与HLA-G特异性抗体87G反应。该研究结果为进一步的复性工作奠定了基础。
关键词：
HLA-G 原核表达 重组蛋白 包涵体
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
唐俊 陆娟 许惠芬 陈捷
【目的】对康氏木霉HEX1蛋白进行原核表达和纯化,为进行抗体制备及深入研究HEX1功能奠定基础。【方法】采用RT-PCR方法扩增康氏木霉hex1基因,构建pMD19-T-hex1重组克隆质粒,在此基础上构建pET28a-hex1表达载体,转化E.coli BL21(DE3)细胞。通过IPTG诱导表达,对重组HEX1蛋白进行可溶性分析、纯化及鉴定。【结果】成功克隆了长660bp的hex1基因并构建了融合表达载体,HEX1蛋白在IPTG诱导下得到表达。融合蛋白主要以包涵体形式存在,能与抗His标签的兔多克隆抗体发生特异性反应,并纯化出了融合表达蛋白。【结论】康氏木霉HEX1蛋白在原核细胞中得到成功...
关键词：
康氏木霉 HEX1 原核表达 蛋白纯化
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
官丽莉 陈昱 朱栋 韩怡来 崔琪 李海燕 李校堃 姜潮
【目的】获得转金属硫蛋白（ＭＴ）基因的拟南芥植株，为利用植物生物反应器规模化生产ＭＴ奠定基础。【方法】利用融合ＰＣＲ方法，扩增拟南芥ＭＴ基因与油体蛋白ｏｌｅｏｓｉｎ基因的融合基因，将融合基因克隆至表达载体ＰｏＰ上，构建重组质粒ＰｏＰｏｌｅｏｓｉｎＭＴ。采用冻融法将质粒ＰｏＰｏｌｅｏｓｉｎＭＴ转入根癌农杆菌ｅＨＡ１０５中，通过农杆菌介导法转化拟南芥，用ＰＣＲ检测并筛选转基因拟南芥阳性植株，采用ｓＤｓＰＡＧｅ法检测ｏｌｅｏｓｉｎＭＴ融合蛋白的表达，邻苯三酚自氧化法和结晶紫法测定融合蛋白的体外抗氧化活性。【结果】成功构建了植物油体特异表达载体ＰｏＰｏｌｅｏｓｉｎＭＴ，融合蛋白ｏｌｅｏｓｉｎＭＴ在拟南．．．
关键词：
金属硫蛋白 拟南芥 油体蛋白 基因表达
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
官丽莉 陈昱 朱栋 韩怡来 崔琪 李海燕 李校堃 姜潮
【目的】获得转金属硫蛋白（MT）基因的拟南芥植株，为利用植物生物反应器规模化生产MT奠定基础。【方法】利用融合PCR方法，扩增拟南芥MT基因与油体蛋白oleosin基因的融合基因，将融合基因克隆至表达载体pOP上，构建重组质粒pOPoleosinMT。采用冻融法将质粒pOPoleosinMT转入根癌农杆菌EHA105中，通过农杆菌介导法转化拟南芥，用PCR检测并筛选转基因拟南芥阳性植株，采用SDSPAGE法检测oleosinMT融合蛋白的表达，邻苯三酚自氧化法和结晶紫法测定融合蛋白的体外抗氧化活性。【结果】成功构建了植物油体特异表达载体pOPoleosinMT,融合蛋白oleosinMT在拟南...
关键词：
金属硫蛋白 拟南芥 油体蛋白 基因表达
[期刊] 华北农学报
[作者]
李波 倪志勇 范玲
为了深入研究GhCOMT3基因的功能,将GhCOMT3基因构建到原核表达载体pET-28a中,并转化到大肠杆菌BL21(DE3)中。用0.2mmol/L IPTG诱导融合蛋白表达,结果发现,16℃诱导12h、30℃诱导3h和37℃诱导3h后融合蛋白均以包涵体的形式表达;30℃诱导的蛋白表达量最大,之后对包涵体进行变性溶解,进行SDS-PAGE检测,再经过蛋白标记亲和层析柱(His TrapTMHP)纯化得到变性的pET-28a-GhCOMT3融合蛋白,用SDS-PAGE和Western blotting检测纯化效果,鉴定表达产物,目的蛋白相对分子量约为39.119kDa,检测结果与预期一致。结...
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
蓝贤勇 成军 陈宏 张黎颖 陶明亮 伦永志 洪源 郭江
为了更深入研究XTP5蛋白(也称人类次要组织相容性抗原(mHA-8))的生物学功能,以HepG2细胞总RNA为模板、应用RT-PCR技术获得XTP5基因,再利用基因工程技术对其进行克隆和原核重组表达载体构建和诱导表达,成功克隆XTP5基因,并成功构建原核重组表达空载体pET-32a(+)-XTP5;阳性重组质粒转化大肠杆菌E.coliBL21后,在37℃经终浓度1 mmoL/L IPTG诱导5 h后,受体菌大量表达76.88 ku XTP5重组蛋白;West-ern-blot证实宿主菌表达的蛋白特异性好;肝素亲和层析柱纯化表达产物XTP5蛋白效果良好。结果表明,成功克隆了人类XTP5基因,并获...
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