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[期刊] 华北农学报
[作者]
雷其冬 孙旭东 徐慧妮
为进一步研究转录因子TCP4在植物生长发育过程中的调控作用和下游靶基因。利用生物信息学分析转录因子TCP4家族及其蛋白序列,扩增AtTCP4基因CDS序列、构建原核表达载体并诱导纯化获得蛋白,利用凝胶电泳迁移试验(EMSA)验证AtTCP4蛋白与拟南芥功能基因LOX2启动子区域的顺式作用元件结合。生物信息学分析表明,拟南芥TCP蛋白含有非典型的螺旋-环-螺旋(bHLH)结构域;系统进化树表明,AtTCP4属于Ⅱ类TCP蛋白;蛋白三级结构预测表明:转录因子TCP4可以形成同源或异源二聚体。特异性引物扩增获得AtTCP4基因的CDS序列,其开放阅读框(ORF)长为1 263 bp。构建原核表达载体pET-28a-AtTCP4并转化到Rosetta(DE3)感受态中,经IPTG诱导、纯化和Western Blot检测证明获得AtTCP4蛋白。EMSA试验验证AtTCP4蛋白能够结合到功能基因LOX2的顺式作用元件。转录因子TCP4结合功能基因LOX2启动子区域,影响植物激素茉莉酸的生物合成,调控植物的生长发育过程。
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
郭佳 郁品泽 贾敏 郁飞
[目的]制备乙烯应答基因HLS1多克隆抗体,在过表达植物中检测HLS1的积累,为深入研究HLS1响应乙烯信号通路的分子机制奠定基础。[方法]构建pET28a-HLS1c原核表达载体,转化到大肠杆菌BL21(DE3)中,用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导获得重组蛋白HLS1c-His;镍柱亲和纯化重组蛋白后免疫家兔获得抗HLS1血清,利用抗原亲和纯化抗血清获得高纯度的HLS1多克隆抗体;用HLS1抗体和GFP抗体,检测原生质体瞬时转化体系中GFP-HLS1c融合蛋白的表达;用农杆菌蘸花法获得过表达GFP-HLS1g的转基因植物,用HLS1抗体和GFP抗体检测GFP-HLS1g融合蛋白的表达。[结果]成功构建了原核表达载体pET28a-HLS1c,并在大肠杆菌系统中诱导获得重组蛋白HLS1c-His,且多以包涵体形式存在。纯化的HLS1c-His多克隆抗体,能清晰检测到约80 ng原核表达的HLS1抗原。纯化的HLS1抗体不仅能检测到原生质体中瞬时表达的GFP-HLS1c融合蛋白,也能检测到过表达转基因植物株系中的GFP-HLS1g融合蛋白,并且与标签蛋白GFP对应抗体所检测到的特异性条带大小一致。[结论]成功制备了拟南芥HLS1蛋白多克隆抗体,为HLS1蛋白在植物发育中的功能研究奠定了基础。
[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
喻德跃 F.Quigley R.Mache
报道了从模式植物拟南芥花ｃ Ｄ Ｎ Ａ 文库中分离鉴定的一个克隆。该ｃ Ｄ Ｎ Ａ 的长度为 ８８７ ｂｐ，其编译的蛋白质推断为２６８ ａａ（氨基酸），与大豆营养贮藏蛋白（ Ｖ Ｓ Ｐ）的同源率达 ５０％ 。 Ｎｏｒｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔ 分析表明，该基因在拟南芥叶片中仅有微量表达，但在花蕾、幼荚及茎中表达量丰富。采用发育后期的花为材料进行原位杂交，发现该基因的表达仅限制于子房壁。
[期刊] 林业科学
[作者]
杨丽 陈东亮 彭镇华 赵韩生 高志民
GRAS家族HAM(Hairy Meristem)亚家族是一类转录因子,对植物的生长发育和形态建成具有重要作用。利用RT-PCR和RACE技术从麻竹中得到一个HAM同源基因,命名为DlSCL6。该基因全长2 006 bp,含有5'非编码区129 bp,3'非编码区266 bp,编码区1 611 bp。DlSCL6蛋白具有LHRⅠ,VHIID,LHRⅡ,PFYRE,SAM 5个保守域,且与某些单子叶植物的SCL6蛋白有较高的一致性,与拟南芥有部分一致性,为43%。DlSCL6基因在大肠杆菌中表达,获得分子量约为60 kDa的重组蛋白。在拟南芥中正义表达DlSCL6基因的植株营养期延长,开花延迟,...
关键词：
麻竹 转录因子 拟南芥 异位表达
[期刊] 福建农林大学学报(自然科学版)
[作者]
谢丽雪 黄科 李宾 黄志伟 郑金贵
根据GenBank上已公布的植物黑芥子酶基因序列设计引物,采用RT-PCR和3′/5′-RACE相结合的方法,从芥蓝中克隆出黑芥子酶基因全长cDNA序列.序列全长为1832 bp,开放阅读框为1647 bp,编码549个氨基酸,含有糖基水解酶家族Ⅰ(Glyco_hydro_1)活性位点,GenBank登录号为DQ767973.该核苷酸序列与十字花科其他植物的黑芥子酶基因序列具有较高的同源性,同油菜、萝卜、芥菜和大白菜的同源性达90%以上.利用pET28-α(+)构建芥蓝黑芥子酶基因的原核表达载体,转入大肠杆菌BL21,经IPTG诱导表达,SDS-PAGE检测表明表达蛋白的分子质量约为65 ku...
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
王玥 梁爽 梁慧珂 郁飞 齐亚飞
【目的】将拟南芥叶绿体发育必需蛋白ＰＡＣ进行大肠杆菌原核表达和纯化，并免疫家兔，获得针对ＰＡＣ蛋白的多克隆特异性抗体，为进一步研究ＰＡＣ蛋白在叶绿体发育中的功能提供保证。【方法】将编码拟南芥ＰＡＣ蛋白的ＣＤＮＡ克隆至原核表达载体ＰＥＴ－２８Ａ中，转化ＢＬ２１（ＤＥ３）表达菌，经ＩＰＴＧ诱导后，对诱导产生的ＰＡＣ蛋白进行镍柱亲和纯化和ＳＤＳ－ＰＡＧＥ割胶纯化，并将纯化的ＰＡＣ蛋白通过皮下注射免疫家兔，利用分离得到的抗血清，针对拟南芥野生型、ＰＡＣ敲除突变系ＰＡＣ－１和ＰＡＣ过表达系ＰＡＣＯＥ的总蛋白进行免疫印迹检测。【结果】成功构建了拟南芥基因ＰＡＣ的原核表达载体ＰＥＴ－２８Ａ－ＰＡＣ，在３７℃．．．
关键词：
叶绿体 PAC蛋白 原核表达 抗体制备
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
周亚媚 梁爽 齐亚飞 刘夏燕
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
王艺霖 赵丽伟 李昆志
【目的】构建拟南芥转录因子Dof1基因的原核表达载体,进行原核表达并制备其蛋白抗体。【方法】利用RT-PCR方法从拟南芥中克隆转录因子Dof1基因,将其连接到原核表达载体pET-32a(+)上,构建重组原核表达载体pET32a(+)-Dof1,经酶切鉴定和测序验证后将其转化至大肠杆菌BL21中,经IPTG诱导后,纯化重组蛋白,以分离到的重组蛋白为抗原免疫小鼠制备抗血清,检测植物中Dof1蛋白表达水平。【结果】成功构建了拟南芥转录因子Dof1基因的原核表达载体pET32a(+)-Dof1,在28℃、1mmol/L IPTG诱导6h的大肠杆菌中可高效表达分子质量约为42ku的重组蛋白,其分泌到细胞...
关键词：
Dof 转录因子 载体构建 原核表达
[期刊] 华北农学报
[作者]
段红英 丁笑生
以拟南芥幼苗总RNA为模板,采用RT-PCR技术扩增到DREB2A基因,并将其克隆到植物表达载体pCAM-BIA1304中CaMV 35 S启动子与poly(A)终止子之间。酶切鉴定及测序列结果都表明,成功构建了植物表达载体pCAMBIA1304-DREB2A。另外,获得了携带DREB2A基因的根瘤农杆菌菌株,为以后转基因植物工作奠定了基础。
[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
张芸 李会 车丽玲 黄思齐 邱承祥 杨志敏
MicroRNAs(miRNAs)是一类内源性长度约为21～24个核苷酸,在基因表达、生长发育、细胞周期及环境胁迫等方面起着重要作用的单链非编码小分子RNA。研究表明:植物miRNAs通过转录后以切割的方式对其靶基因的表达起着负调控作用。miR395的靶基因分别为ATP硫酸化酶和硫转运体SULTR2;1,两者在硫同化及转运中起着重要的作用。为了进一步探究miR395的功能,本研究利用PCR法从拟南芥中克隆了miR395d前体基因,并与pCAMBIA1304载体连接,构建了miR395d前体基因的过量表达载体,通过根癌农杆菌介导法将其转化到甘蓝型油菜特选4号中,目前已获得了转基因植株。
[期刊] 华北农学报
[作者]
胡京蕊 沈金宝 李晶岚 李晓旭 赵宝存 葛荣朝
提取拟南芥总RNA,反转录获得cDNA后PCR扩增获得1 212 bp目的基因AtSTK。将该基因片段构建到PET-32a表达载体,转化大肠杆菌Rosetta菌,用IPTG进行诱导表达。该基因表达的最佳诱导条件为IPTG终浓度1mmol/L,诱导时间为4 h,此时融合蛋白表达量最高。该融合蛋白存在于包含体中,经包含体溶解、复性,最终纯化获得了AtSTK融合蛋白,为AtSTK蛋白的理化性质研究奠定了基础。
[期刊] 中国农业科学
[作者]
李志邈 杨悦俭 杨飞 叶青静 王荣青 阮美颖 周国治 姚祝平
目的克隆获得番茄根特异表达启动子,为利用基因工程技术创制番茄新种质奠定基础。方法利用Clontech公司的基因组步移(genome walking)技术,扩增番茄根特异表达基因LeGRP2的上游调控序列,并构建植物表达载体,利用农杆菌介导法转化拟南芥,以GUS为报告基因研究该调控序列的组织表达特异性。结果以番茄基因组DNA为模板,经过2次基因组步移,获得了LeGRP2基因上游1959bp的调控序列(GenBank登录号:EU262719),分析发现含有9个与根特异表达相关的顺式作用元件ROOTMOTIFTAPOX1。转基因拟南芥的组织化学染色分析表明,GUS基因主要在拟南芥的根部特异表达。结论...
[期刊] 湖南农业大学学报(自然科学版)
[作者]
王丽华 李杰勤 詹秋文 樊飞飞
以高粱品系早亨加利为材料,通过RT–PCR扩增,克隆高粱Sb CAD4基因。测序结果表明,克隆的Sb CAD4基因与NCBI基因库中高粱IS11861品系只在编码序列第548位有1个碱基的差异,而二者的氨基酸序列完全一致。进化树分析结果表明,Sb CAD4与拟南介、水稻、玉米的木质素合成CAD基因位于同/L1个群中。比对分析结果表明,Sb CAD4与木质素合成基因具有相同的结构域。将构建正确的重组质粒(p MAL–Sb CAD4)转化入大肠杆菌菌种BL21中进行诱导表达的结果表明,IPTG的最佳诱导浓度为0.5 mmol/L。经Amylose Resin亲和层析柱纯化后,Sb CAD4融合蛋白...
[期刊] 华北农学报
[作者]
蒋琛茜 瓮巧云 樊锦涛 王冠宇 董丽萍 邢继红 董金皋
为构建拟南芥抗病相关T1N6_22基因的原核表达载体并进行高效表达,获得纯化的T1N6_22蛋白,以拟南芥Col-0的c DNA为模板,扩增获得了T1N6_22基因CDS,对其进行克隆、测序后与含有GST标签蛋白的p GEX4T-1载体相连,构建T1N6_22的原核表达载体p GEX4T-1-T1N6_22-GST。经酶切和测序鉴定正确后,将构建好的载体及空载体转化大肠杆菌BL21。结果表明,在大肠杆菌BL21菌株中成功表达了与标签蛋白融合的T1N6_22蛋白,大小约57 k Da。SDS-PAGE分析表明,高效表达的诱导条件为0.1 mmol/L IPTG诱导培养3 h。研究结果为进一步T1...
关键词：
拟南芥 T1N6_22 原核表达 纯化
[期刊] 浙江农林大学学报
[作者]
周佳平 林新春 徐英武
SEPALLATA3(SEP3)属于花器官建成ABCE模型中的E类基因,为了揭示SEP3蛋白是如何形成多聚体的,以及多聚体与其生物学功能之间的联系,开展了拟南芥Arabidopsis thaliana AtSEP3蛋白质体外可溶性表达实验,构建了原核表达载体,并在大肠埃希菌Escherichia coli细胞中进行重组蛋白的诱导表达。从蛋白不同的结构域、诱导时间和诱导温度等方面对蛋白的可溶性表达进行了分析。最后以pET-15b为表达载体,大肠埃希菌表达菌株E.coli‘Rosetta’为宿主菌株,22℃诱导表达15 h,获得不同片段的AtSEP3可溶性蛋白。通过镍柱及分子层析色谱柱分离纯化,表...
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