将蔗糖非发酵基因相关蛋白激酶AKIN11克隆到植物表达载体pEGAD的35S启动子下游与GFP融合,基因枪法导入洋葱表皮细胞进行瞬时表达,发现集中在细胞核内表达.农杆菌介导花序浸泡法转化拟南芥,Basta筛选和RT-PCR鉴定得到两个遗传稳定的T3代转基因株系.突变体和野生型的表型没有明显差异,但突变体叶片中淀粉含量较野生型增加.RT-PCR分析淀粉合成途径关键酶的mRNA水平,发现突变体中腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶表达量增加,而α-淀粉酶却没有变化.表明AKIN11基因可能在拟南芥淀粉积累途径中起着重要的调节作用.

【目的】分析拟南芥中功能未知基因PMRP(putative membrane related protein)的表达特性;明确PMRP在调控拟南芥生长发育过程中的作用。【方法】利用生物信息学方法,寻找拟南芥中与PMRP含相同结构域的基因,并绘制进化树;利用Real-time PCR技术分析PMRP在生长8和21 d的拟南芥根、茎中的相对表达量,比较生长21 d的拟南芥第1、2、3、4对莲座叶及茎生叶中PMRP的表达情况,分析花器官的萼片、花瓣和雄蕊及生长后期拟南芥种子中PMRP的表达量的高低;构建35S::PMRP过表达载体,转化Columbia野生型拟南芥,通过RT-PCR技术验证PMRP的...

【目的】分析唐菖蒲AOS基因的表达模式及其对JAs生物合成的影响,研究GhAOS基因对伤害胁迫的应答机理。【方法】利用基因枪的方法进行GhAOS的亚细胞定位分析;运用Real-time RT-PCR技术分析GhAOS基因的表达模式,采用农杆菌介导的侵染拟南芥花粉法进行GhAOS基因的过表达分析。【结果】GhAOS定位在叶绿体的内囊体膜上;该基因在唐菖蒲各组织中均表达,其中在籽球和匍匐茎中表达量最高;经过0.1—0.5 mmol.L-1的茉莉酸甲酯(MJ)处理后,逐渐提高了GhAOS在球茎中的表达量和内源MJ含量;在拟南芥中过量表达该基因,提高了拟南芥的耐盐性和抗旱性;经过机械损伤后提高了转基因...

以甜高粱品种Roma为试验材料,在生物信息学分析基础上,采用逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)方法,克隆了SbAGL6基因的编码区序列。序列分析表明,SbAGL6基因编码具有256个氨基酸的转录因子,在其N端含有MADS-box结构域,中间存在K-box结构域,与拟南芥AtAGL6等直系同源基因在核苷酸和氨基酸序列上都有较高的相似性。为验证其生物学功能,采用Gateway的方法,构建了SbAGL6基因的可诱导过表达载体。利用农杆菌介导侵染拟南芥的方法,获得了SbAGL6基因的转基因拟南芥植株,并对其进行了功能鉴定。结果表明,未施加诱导物地塞米松Dex时,转基因拟南芥与野生型生长一致,而施加...

为研究共生信号途径相关基因在非宿主植物中的表达情况,通过生物技术及合成生物学方法,将10个能在拟南芥根中表达的启动子和10个百脉根共生信号传递的关键基因分别构建2个多基因表达载体,即pUNS6(含6个基因)和pDNS4(含4个基因)。结果表明:利用毛根转化互补相应豆科植物的突变体,都能恢复突变体的结瘤功能,说明克隆的目的基因都具有生物学功能;通过根癌农杆菌介导的花序侵染,将pUNS6和pDNS4分别转入拟南芥中,对阳性植株分离和鉴定,在转基因T_0、T_1、T_2代植株中都鉴定到目的基因,表明多个共生基因

MicroRNAs(miRNAs)是一类内源性长度约为21～24个核苷酸,在基因表达、生长发育、细胞周期及环境胁迫等方面起着重要作用的单链非编码小分子RNA。研究表明:植物miRNAs通过转录后以切割的方式对其靶基因的表达起着负调控作用。miR395的靶基因分别为ATP硫酸化酶和硫转运体SULTR2;1,两者在硫同化及转运中起着重要的作用。为了进一步探究miR395的功能,本研究利用PCR法从拟南芥中克隆了miR395d前体基因,并与pCAMBIA1304载体连接,构建了miR395d前体基因的过量表达载体,通过根癌农杆菌介导法将其转化到甘蓝型油菜特选4号中,目前已获得了转基因植株。

【目的】 为探究拟南芥IDD基因家族中AtIDD4基因在调控植物生长发育与抗逆反应应答中的作用，本研究构建了拟南芥AtIDD4基因过量表达植物。【方法】提取拟南芥叶片的总RNA反转成cDNA，利用特异性引物PCR法扩增出CDS片段。将目的片段与花椰菜花叶病毒的35S启动子连接得到重组质粒，将质粒转化到农杆菌中，构建35S-AtIDD4CDS农杆菌表达载体，利用花序浸染方法将其导入拟南芥野生型植株（WT）中。将收取的T0代种子播种于含有潮霉素的MS培养基上进行抗性筛选直获得T_(3)代植株，得到AtIDD4基因的超表达植株AtIDD4-OE。【结果】半定量和定量RT-PCR结果表明，相较于拟南芥野生型植株，AtIDD4-OE 植株中AtIDD4基因的表达量显著提高，约为野生型植株的2倍。表型观察结果表明，在MS培养基中垂直培养14 d的AtIDD4-OE 幼苗根长和鲜重等指标显著低于WT幼苗。土壤中生长14 d的AtIDD4-OE植株与WT植株比较，生长状态弱，植株矮小，莲座叶面积较小。【结论】拟南芥AtIDD4基因的过量表达会抑制拟南芥植株的生长，其在拟南芥生长发育过程中以负调控因子发挥作用。

利用RT–PCR的方法检测了AtSb3在拟南芥的表达情况;在构建AtSb3基因启动子与GUS融合表达载体并获得拟南芥转化子的基础上,用组织化学染色方法对AtSb3基因在拟南芥中的表达进行了研究。RT–PCR的结果表明:只在拟南芥根中检测到AtSb3的表达,在茎、叶、花和果荚中均检测不到AtSb3的表达。GUS组织化学染色结果显示:在刚萌动的种子中,AtSb3主要在胚根部位表达,其他部位不表达;在种子萌发后的子叶展开期,AtSb3在根尖部位表达,其他部位不表达;在4～5叶期幼苗中,AtSb3在地上部分没有表达,只在主根和各级侧根的根尖部位表达;在根尖部位,AtSb3基因在根冠与分生区细胞结合部位...

【目的】盐胁迫是影响植物生长发育的不利环境因子。蛋白激酶PKS5作为植物盐超敏感信号转导途径的重要组分，在植物响应盐胁迫过程中具有重要调节功能。本文旨在生理水平和分子水平上，探究胡杨PePKS5基因在植物耐受盐胁迫过程中的调节作用。【方法】克隆胡杨PePKS5基因，并在拟南芥中过表达，获得T_3代转基因拟南芥纯合体。观察盐胁迫下转基因拟南芥株系的耐盐表型，测定其过氧化物酶（POD）、过氧化氢酶（CAT）和超氧化物歧化酶活性及盐胁迫响应基因的表达量。利用非损伤微测技术测定转基因拟南芥株系根尖Na~+、K~+动态离子流，利用激光共聚焦显微镜观测转基因拟南芥株系根尖Na~+和H_2O_2含量。测定盐处理后转基因拟南芥土培幼苗的叶绿素荧光参数、光合参数等生理指标，揭示PePKS5基因在盐胁迫下对拟南芥的生理调节作用。构建亚细胞定位载体，通过瞬时转化烟草，对PePKS5蛋白进行亚细胞定位观测。【结果】（1）PePKS5基因的CDS序列编码417个氨基酸，PePKS5氨基酸序列与毛白杨PtPKS5相似度最高，并且亲缘关系最近。（2）PePKS5定位于细胞质和细胞核中。（3）NaCl处理6 h后，胡杨叶片PePKS5基因表达量上调，72 h后逐渐恢复至正常水平。（4）盐胁迫下过表达PePKS5基因的拟南芥株系（PePKS5-OE10和PePKS5-OE15）的生存率和根长均明显高于野生型（WT）和转空载体（VC）株系。（5）与WT和VC株系相比，PePKS5-OE10和PePKS5-OE15株系的POD和CAT活性增强，APX1和CAT2基因的表达量均升高。（6）盐胁迫下PePKS5-OE10和PePKS5-OE15株系的Na~+外排和K~+的内流明显高于WT和VC株系，并且在根尖中积累的Na~+浓度和H_2O_2浓度明显低于WT和VC株系。（7）盐胁迫下PePKS5-OE10和PePKS5-OE15株系的叶绿素相对含量、PSⅡ最大光量子效率、实际光合量子产量和相对电子传递速率均高于WT和VC株系。（8）盐胁迫下PePKS5-OE10和PePKS5-OE15的净光合速率高于WT和VC株系，而胞间CO_2浓度、气孔导度和蒸腾速率均低于WT和VC株系。【结论】过表达胡杨PePKS5基因能够增强拟南芥对Na~+的外排能力，维持植物活性氧的平衡状态，以及保持相对稳定的光合作用能力，从而提高拟南芥的耐盐能力。

衰老是植物界广泛存在的一种自然现象,在植物整个发育过程中具有重要的地位和生物学意义。叶片衰老是植物生长发育的最后一个阶段,在该过程中叶绿素、核酸、脂质、蛋白和其他大分子等被降解,细胞程序化死亡并引起叶色发生变化,然而目前关于这个生物学过程如何启动和如何调控的研究还比较有限。当植物受到外界环境的影响时也会加速其自身的衰老,蛋白磷酸酶催化的蛋白质去磷酸化反应会在植物适应外界环境的多种生命活动过程中发挥重要的作用。2C型蛋白磷酸酶是植物中数量较多的一类,其通过脱磷酸化来调节细胞的生长发育以及信号传递,从而调整体内相关基因的变化来对抗逆境的胁迫。通过试验研究发现并克隆了一个新的参与水稻(Oryza sativa)叶片衰老进程调控的2C型蛋白磷酸酶编码基因OsSAPP2,并通过双元表达载体构建获得了组成型异源过表达OsSAPP2基因的转基因拟南芥(Arabidopsis thaliana)。通过对35S-OsSAPP2转基因拟南芥的表型观察可知,35S-OsSAPP2转基因拟南芥出现莲座叶片变小、数量减少,抽苔和开花时间明显提前,株高增加,叶片颜色变浅、衰老加速等表型。在叶龄依赖和人工黑暗诱导的衰老过程中,过表达OsSAPP2基因导致转基因拟南芥叶绿素含量下降,叶片萎蔫加剧。实时荧光定量PCR检测结果表明,35S-OsSAPP2转基因拟南芥中衰老标志基因SAG12,衰老关键转录因子NAC2、NAP、WRKY6和叶绿素降解关键酶编码基因ACD1等表达量上升;从植物进入衰老过程开始,光合作用关键基因RbcS和RbcL表达量快速下降。可见,OsSAPP2基因参与植物叶片衰老进程的调控,是衰老进程的正向调控因子。

为了研究拟南芥核酸酶AtCaN2基因在植物生长发育过程中的作用与功能,从拟南芥中克隆了核酸酶AtCaN2基因,并对该基因进行生物信息学分析,亚细胞定位分析,蛋白质诱导、表达、纯化及功能研究。结果表明,AtCaN2蛋白等电点为8.45,化学式为C_(1116)H_(1788)N_(310)O_(335)S_3,共含有3 552个原子数,为亲水性蛋白;AtCaN2与十字花科亚麻荠的同源性较高,同源性为87.89%,与谷子、高粱和玉米的同源性较低,同源性分别是56.42%,57.35%,56.47%,且在氨基酸序列中间具有高度保守的D-X-D序列;同时进化树分析显示AtCaN2与十字花科亚麻荠的亲缘性最近,与谷子、玉米等禾本科植物的亲缘性比较远,这些结果同氨基酸序列比对的结果一致;亚细胞定位结果显示其定位于细胞质,与预测结果相符;蛋白质诱导和纯化得到大小约为35 ku的His-AtCaN2融合蛋白;Western Blot分析显示,诱导表达的融合蛋白正确翻译表达,且没有出现结构上的断裂或者降解的情况;小量诱导和大量诱导均有点突变后的His-AtCaN2(M)融合蛋白表达,且纯化后得到了点突变His-AtCaN2(M)较单一的条带;蛋白酶活性分析表明,His-AtCaN2融合蛋白对核酸底物具有降解能力,表现出较高的活性,而His-AtCaN2(M)点突变融合蛋白对核酸底物没有降解能力,底物基本上未降解。研究结果可以为下一步在植物体内研究AtCaN2基因的相关机理作用提供基础。

EPF/EPFL基因家族成员编码一类富含半胱氨酸的分泌型小肽，本研究通过实时荧光定量PCR检测、核盘菌接种和二氨基联苯胺(DAB)染色分析11个EPF/EPFL基因在拟南芥对核盘菌防御反应中的作用.荧光定量PCR分析显示，接种核盘菌后，EPFL1、EPFL2、EPFL3、EPFL4、EPFL5、EPFL6和EPFL9的表达水平至少在一个时间点明显上调.核盘菌接种处理后，epfl1、epfl2、epfl3、epfl4、epfl5、epfl6和epfl9拟南芥单突变体叶片的病斑面积与野生型拟南芥(WT)相似，且DAB染色显示的H_2O_2含量也与WT没有明显的差别；epfl1,2,4,6四突变体拟南芥叶片的病斑面积明显大于WT.DAB染色结果显示，与WT相比，epfl1,2,4,6四突变体拟南芥的H_2O_2含量明显增多.荧光定量PCR结果进一步显示，与WT相比，核盘菌抗病相关基因YDDs在epfl1,2,4,6四突变体拟南芥接种核盘菌前后的表达量均明显下调.这说明EPFL1、EPFL2、EPFL4和EPFL6在拟南芥应答核盘菌的防御反应过程中存在冗余功能，通过介导YDDs基因的表达，共同调控植物免疫反应.

【目的】茉莉酰氨基酸结合物合成酶(jasmonoyl amino acid conjugate synthase,JAR1)可以催化茉莉酸(jasmonic acid,JA)形成茉莉酸的活性形式茉莉酸异亮氨基酸复合体(jasmonic acid-isoleucine,JA-Ile)，从而激活JA信号途径。JA信号途径在介导植物盐胁迫的响应中发挥重要作用，因此，探究AtJAR1在植物耐盐性中的功能对于研究JA信号途径影响植物耐盐性的机制具有重要作用。【方法】运用CRISPR/Cas9基因编辑技术，创建了2个不同的拟南芥Arabidopsis thaliana AtJAR1基因突变体，并对这2个突变体进行地上部生物量的统计分析和JA信号标记基因的表达分析，以确定AtJAR1基因功能缺失。之后，观察分析不同浓度氯化钠和脱落酸(ABA)处理对jar1突变体的种子萌发和幼苗建成的影响，明确AtJAR1基因对拟南芥耐盐性的影响。最后，通过比较分析盐处理前后野生型和突变体的钾离子(K~+)和钠离子(Na~+)质量摩尔浓度，以及高亲和力K~+转运蛋白基因AtHAK5的表达变化情况，初步探究AtJAR1基因在拟南芥耐盐性中的功能。【结果】JA信号标记基因AtVSP1和AtVSP2的表达量大幅下调，表明AtJAR1基因功能丧失。与点突变产生的jar1#1突变体不同的是，这2个突变体表现为前3周生长加快，之后逐渐减缓并出现叶片萎蔫的表型。同时，AtJAR1突变可以缓解盐胁迫和ABA对种子萌发和根系生长产生的抑制作用。此外，盐胁迫下AtJAR1突变可以促进AtHAK5的表达和根系对K~+的吸收转运。【结论】JA信号途径可能通过与ABA交互作用影响AtHAK5的表达量，以调节植物根系对K~+的吸收转运，进而改变细胞内K~+/Na~+平衡，最终影响植物耐盐性。图8表2参52

【目的】分析拟南芥中仅含START结构域(the lipid/sterol-binding St AR-related lipid transfer protein domains)亚家族成员的启动子元件及表达特性,阐明启动子元件与表达特性的相互关系,为明确仅含START结构域亚家族的生物学功能,解析植物生长发育机理、更好地促控植物生长提供理论依据。【方法】利用生物信息学方法分析仅含START结构域亚家族6个成员的亲缘关系及各自启动子区所包含的所有元件,对启动子元件的功能进行分析和分类;利用real-ti

【目的】从野生型拟南芥中克隆抗寒基因ICE1,通过农杆菌介导法将ICE1基因转到烟草中,对其功能进行研究。【方法】以三叶一心期拟南芥幼苗为材料,提取其总RNA,通过RT-PCR扩增得到ICE1基因的完整开放阅读框序列;构建以抗除草剂Bar基因为筛选标记的植物表达载体pCAMBIA3301-ICE1,通过农杆菌介导法转入到烟草中,对阳性植株进行PCR检测和生理生化指标测定,并对ICE1基因在转基因烟草植株中的表达特征进行分析。【结果】成功克隆了拟南芥抗寒基因ICE1,其完整开放阅读框长1 485bp。系统进