为了解不同类受体蛋白激酶RLKs激酶域响应病原相关分子PAMPs信号强度的差异,本研究将拟南芥FLS2的胞外域(NT)与6种不同RLKs的激酶域(KD)组合为重组RLKs(rRLKs),构建融合基因表达载体,并通过拟南芥原生质体瞬时表达的方法,将rRLKs/FLS2、35S::GUS(内参)和FRK1::Luciferase(响应报告载体)共转化到拟南芥fls2突变体叶肉原生质体细胞中;后经flg22处理后,通过对萤光素酶(Luciferase)和葡糖苷酸酶(GUS)活性的定量分析和比较,鉴定不同RLKs

为了研究玉米蛋白激酶ZmSPK1在植物体内亚细胞水平上的分布情况,利用绿色荧光蛋白基因gfp为报告基因,分别构建了以35S为启动子表达ZmSPK1-GFP融合蛋白和GFP的植物表达载体35S∷ZmSPK1-GFP和35S∷GFP,用花粉浸醮的方法将表达载体转入拟南芥,筛选稳定表达株系,在共聚焦激光扫描显微镜下观察ZmSPK1在植物细胞中的定位。研究结果表明:融合蛋白ZmSPK1-GFP的荧光分布与游离GFP相似,在细胞浆及细胞核内均可见。与单独表达GFP相比,融合蛋白ZmSPK1-GFP在核内信号更强,推测ZmSPK1是可溶性蛋白,定位在核内。

为了获得纯化的SnRK1.1与FD蛋白,分析蛋白激酶SnRK1.1是否能够磷酸化开花调控途径中的转录因子FD,成功克隆了1 608 bp的SnRK1.1基因以及858 bp的FD与FD-T282A基因,分别与PGEX-4T-3载体连接,获得原核表达载体GST-SnRK1.1、GST-FD和GST-FD-T282A,并分别转化大肠杆菌BL21菌株;SDS-PAGE电泳和考马斯亮蓝染色(CBB)表明,0.5 mmol/L IPTG能够成功诱导出GST-SnRK1.1、GST-FD和GST-FD-T282A蛋白

以紫云英类受体蛋白激酶Ｎｉｐ４３的Ｓ－ＴＫＳ结构域构建诱饵载体，通过酵母双杂交技术，筛选获得１７个候选的阳性克隆。经过测序分析和ＢｌａＳＴ比对，最终确定了１个互作蛋白ＥｐＮ。ＥｐＮ蛋白是网格蛋白聚合反应中的配体蛋白，可调控网格蛋白的聚合反应。通过实验验证显示，靶蛋白ＥｐＮ与Ｎｉｐ４３蛋白互作最强的区域为ＥＮＴＨ／ａＮＴＨ结构域。ＲＥａｌ－ＴｉｍＥ ｑ ｐＣＲ检测表明，ＥｐＮ基因参与了根瘤菌早期结瘤过程。

LRR类受体激酶RH4基因在花生黄曲霉敏感品种发育种子的种皮中上调表达。基于这类受体激酶多由于序列的变异导致抗性的变异,笔者将数据库中花生抗黄曲霉和敏感品种相似基因编码的蛋白进行序列比较分析,发现抗性品种与敏感品种的类似蛋白序列有很大差别。用荧光定量PCR方法对抗性品种KB153与敏感品种JH1012发育中不同时期的果实和部位进行差异表达分析,结果表明,果实发育的早期类受体蛋白激酶的大量表达可能是导致黄曲霉抗性的重要原因之一。

【目的】盐胁迫影响作物的产量和品质,而作物的耐盐性受特定基因的调控。在前期获得谷子类受体蛋白激酶基因SiRLK35过表达水稻株系的基础上,拟结合植株在盐胁迫下的表型,对部分盐胁迫指标及响应基因的表达模式进行检测和验证,解析谷子SiRLK35参与盐害响应的可能机制。【方法】选取谷子SiRLK35过表达水稻株系,分别为过表达株系(over-expression,OE)-1(OE-1)、OE-2和OE-3,以野生型中花11为对照,实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,qRT-PCR)检测各株系中SiRLK35的表达情况;分别用含0、150和200 mmol·L~(-1) NaCl的MS培养液处理三叶期的对照及转基因株系幼苗,观察其表型,统计150 mmol·L~(-1) NaCl处理3d后苗长及根长;用150 mmol·L~(-1) NaCl处理四叶期幼苗,统计处理14 d后材料干重、死亡率和死叶率,对各材料的耐盐性进行评价;进一步挑选SiRLK35过表达程度高且耐盐表型好的OE-1株系,利用3,3’-二氨基联苯胺(3,3’-Diaminobenzidine,DAB)和氮蓝四唑(nitrotetrazolium blue chloride,NBT)染色检测其胁迫下过氧化物积累及超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)和过氧化物酶(peroxidase,POD)的活性;并对部分盐害响应基因的表达模式进行检测。【结果】谷子SiRLK35在株系OE-1中的相对表达量最高;150 mmol·L~(-1)NaCl处理3 d幼苗后,中花11苗长和根长的生长受抑制程度均大于SiRLK35过表达株系,其中OE-1的受抑制程度最小;四叶期幼苗经150 mmol·L~(-1) NaCl处理14 d后,转基因株系地上部和地下部干重降低幅度均低于对照,且幼苗死亡率和死叶率均低于对照;盐胁迫下对照过氧化染色反应明显,O~(2-)和H_2O_2的积累均高于过表达植株,SOD和POD抗氧化酶活性均高于对照;部分盐害响应基因在SiRLK35过表达株系中表现为上调,其中,OsLEA3在盐处理24 h的相对表达量是对照中的1.9倍。【结论】谷子SiRLK35异源转化水稻获得的过表达株系对盐胁迫具有一定的抗性,SiRLK35可通过调控抗氧化酶活性及相关信号途径,从而参与盐害响应。

【目的】对紫花苜蓿(Medicago sativa L.cv.Zhongmu-1)stress-induced protein kinase gene 1(Ms SIK1)进行克隆与表达研究,了解该基因的分子机制及其应用。【方法】以紫花苜蓿叶片总RNA为模板,根据同源克隆设计简并引物,利用RT-PCR结合RACE技术,获得Ms SIK1的编码序列。利用同源性比对进行序列分析。通过SMART网站(http://smart.embl-heidelberg.de/)模拟该基因的蛋白结构。构建Ms SIK1的亚细胞定位瞬时表达载体,使用基因枪转化法将Ms SIK1与GFP在洋葱表皮细胞中融合瞬时表达并...

钙是植物必需的大量元素之一,同时钙离子(Ca(2+))是细胞信号转导的第二信使。钙依赖蛋白激酶(calcium-dependent protein kinase,CDPK)作为Ca(2+)的感受器普遍存在于植物和部分原生动物中,是植物特有的一类丝氨酸/苏氨酸型蛋白激酶,参与了多种Ca(2+)介导的信号通路,在植物发育信号和逆境信号转导中具有重要作用。本文概述了钙依赖蛋白激酶在植物体内的分布、结构、底物、功能以及大豆CDPK的研究进展,旨在为今后培育抗逆植物品种提供参考依据。

【目的】利用构建的干旱胁迫处理的小麦cDNA文库,通过酵母双杂系统筛选与小麦TaMAPK2互作的蛋白,并对其进行验证分析。【方法】以小麦cDNA为模板克隆得到TaMAPK2,构建pGBKT7-TaMAPK2诱饵载体,将诱饵载体pGBKT7-TaMAPK2质粒以及pGADT7和小麦cDNA文库共转化酵母AH109菌株感受态细胞,在SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade营养缺陷型培养基上30℃培养3—5 d,挑选单克隆于YPDA培养基中培养,吸取1μL各候选克隆的菌液点至于SD/Raf/Gal/x-gal平板上培养,筛选蓝色单克隆。将筛出的单克隆经测序、序列比对分析,初步获得与TaMAPK2...

利用酵母双杂交技术,以结瘤受体激酶(NORK)蛋白的跨膜结构域(TM)为诱饵,进行了与其相互作用靶蛋白的筛选鉴定。结果获得41个候选阳性克隆,通过测序和在NCBI中进行Blast比对分析,发现其中一个具有重要生物学功能的互作蛋白翻译延伸因子AsEF1-α,并将该蛋白相应的编码基因命名为AsEF1-α。进一步的验证表明靶蛋白AsEF1-α与诱饵互作的关键结构域是EF1-α-Ⅲ。

采用qRT-PCR、RACE等方法,获得了拟穴青蟹丝裂原活化蛋白激酶激酶(MAPKK)基因cDNA全长序列。该基因全长1 558 bp,开放阅读框长度为1 224 bp,编码407个氨基酸残基。同源分析显示,该基因编码的蛋白与昆虫的相似性高达70%,推测MAPKK基因在节肢动物具有较高的保守性。经荧光定量PCR检测,MAPKK基因在拟穴青蟹多个组织中有表达,且在脑神经节和卵巢中表达量较高。在拟穴青蟹卵巢发育过程中,MAPKK基因在卵巢发育期(Ⅲ期)表达量最高,发育期为卵母细胞快速生长期,推测MAPKK具有促进卵母细胞快速生长的作用。

为研究LHK1蛋白的功能,构建了pPub-LHK1∶AG-GFP和pFastBac-LHK1表达载体,分别在烟草叶肉细胞和昆虫细胞表达百脉根组氨酸蛋白激酶LHK1跨膜蛋白。结果表明:在烟草和昆虫细胞中LHK1蛋白都能表达,且表达的蛋白在体外都能磷酸化底物(组氨酸转移酶HP1蛋白),具有组氨酸蛋白激酶活性。

　简要介绍了钙依赖型蛋白激酶(Calcium-dependentProteinKinases,CDPKs)的结构特点及家族成员,重点对CDPKs在植物环境胁迫、防御反应、生长发育、离子通道调节和激素信号等方面的生理功能研究进展进行了综述和讨论,并展望了该领域的研究前景。

为了探究ＲＡＣＫ１基因在三角帆蚌免疫系统中的调控机制，采用ＲＡＣＥ技术克隆得到三角帆蚌ＲＡＣＫ１基因（命名为ＨＣＲＡＣＫ１）的Ｃ ＤＮＡ全序列，并对该序列进行分析。结果显示，ＨＣＲＡＣＫ１基因全长为１２４９ ｂｐ，其中开放阅读框９５７ ｂｐ，编码３１８个氨基酸。蛋白质结构域分析显示ＨＣＲＡＣＫ１含有ＲＡＣＫ１家族特有的７个ＷＤ４０结构域。运用荧光定量ｐＣＲ技术分析ＨＣＲＡＣＫ１在正常组织中及受到嗜水气单胞菌侵染和重金属镉暴露后相关组织表达量的变化。结果显示，ＨＣＲＡＣＫ１在各个组织中均有表达，其中闭壳肌中表达量最高；嗜水气单胞菌侵染后，ＨＣＲＡＣＫ１在血淋巴中的表达量逐渐上升，２４ Ｈ时达到峰．．．

为了研究烟草中蛋白激酶CIPK3在植物非生物胁迫应答中的功能,通过同源克隆的方法,在普通烟草品种K326中克隆到1个CIPK家族基因NtCIPK3。利用生物信息学软件对该基因编码蛋白的结构和功能进行了预测分析。该基因包含一个1 272 bp的开放阅读框,编码423个氨基酸残基。蛋白序列分析表明,该蛋白含有一个跨膜结构域,且平均疏水性系数小于0,属于亲水性膜蛋白。蛋白比对分析发现,NtCIPK3含有高度保守的N端激酶区、连接区以及C端调控区,与野生烟草CIPK3的同源性最高,达99%。亚细胞定位预测显示,该蛋白主要定位于细胞核,且具有双分型的核定位信号序列。运用qRT-PCR技术,对该基因的表达特性进行了分析,组织表达分析发现,该基因在烟草的根、茎、叶、花中均有表达,但在叶中表达水平明显高于其他组织,推测可能主要在叶中行使功能。NtCIPK3基因在不同程度上受低钾、高盐、干旱、ABA、H_2O_2、低温处理的诱导,推测NtCIPK3基因在烟草的非生物胁迫应答反应中发挥了重要作用。并成功构建pBI121-NtCIPK3过表达载体,为今后该基因在非生物胁迫下的功能研究奠定了基础。