利用酵母双杂交技术,鉴定拟南芥抗病相关基因T1N6-22的互作蛋白,为进一步明确T1N6-22基因调控拟南芥抗病的分子机制奠定基础。利用Gateway技术,构建T1N6-22基因及其候选互作蛋白基因的酵母双杂交载体AD-T1N6-22、AD-AT1G06050、AD-AT1G21400、AD-AT2G19480、BD-T1N6-22、BD-AT1G06050、BD-AT1G21400和BD-AT2G19480。将空载的AD载体分别与BD-T1N6-22、BD-AT1G06050、BD-AT1G21400和BD-AT2G19480载体组合共同转化酵母感受态细胞,检测各基因的自激活活性,发现T1N6-22、AT1G21400、AT2G19480基因无自激活活性,AT1G06050基因有自激活活性。将AD-T1N6-22载体分别与BD-AT1G06050、BD-AT1G21400和BD-AT2G19480载体组合,BD-T1N6-22载体分别与AD-AT1G06050、AD-AT1G21400、AD-AT2G19480载体组合,进行酵母双杂交试验。结果发现,AD-T1N6-22与BD-AT1G06050、BD-AT1G21400和BD-AT2G19480,BD-T1N6-22与AD-AT1G06050、AD-AT1G21400、AD-AT2G19480共转化的酵母细胞在二缺(-Leu/-Trp)、三缺(-Leu/-Trp/-His)和四缺(-Leu/-Trp/-His/-Ade)培养基上均可以生长,表明T1N6-22与AT1G06050、AT1G21400和AT2G19480在酵母细胞中直接互作。

为构建拟南芥抗病相关T1N6_22基因的原核表达载体并进行高效表达,获得纯化的T1N6_22蛋白,以拟南芥Col-0的c DNA为模板,扩增获得了T1N6_22基因CDS,对其进行克隆、测序后与含有GST标签蛋白的p GEX4T-1载体相连,构建T1N6_22的原核表达载体p GEX4T-1-T1N6_22-GST。经酶切和测序鉴定正确后,将构建好的载体及空载体转化大肠杆菌BL21。结果表明,在大肠杆菌BL21菌株中成功表达了与标签蛋白融合的T1N6_22蛋白,大小约57 k Da。SDS-PAGE分析表明,高效表达的诱导条件为0.1 mmol/L IPTG诱导培养3 h。研究结果为进一步T1...

拟南芥丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶基因AtSTK的过量表达可以明显提高拟南芥的耐盐性。为进一步研究AtSTK基因表达的调控机制,以拟南芥基因组DNA为模板设计引物,扩增获得AtSTK基因的启动子序列,并构建到报告载体pAbAi,将重组报告载体质粒pAbAi-HYT利用BstbⅠ进行单酶切线性化,转化酵母菌株Y1H Gold,线性化的pAbAi-HYT整合到基因组中。然后,将纯化的拟南芥双链cDNA、pGADT7-Rec载体共转化含有报告载体pAbAi-HYT的酵母菌,将菌液涂布到含有100 ng/m L Ab

【目的】绒毛白蜡是重要的盐碱地造林树种，挖掘绒毛白蜡的耐盐潜力，对推动黄河流域盐碱地生态保护和修复具有重要意义。CAMTA是植物抗逆胁迫信号通路中的重要转录激活因子，但绒毛白蜡盐胁迫信号途径中包括FvCAMTA1在内的大部分关键基因，尚未被克隆与鉴定，与FvCAMTA1发生互作的蛋白也不清楚，严重阻碍绒毛白蜡抗盐分子机理研究的瓶颈。本研究挖掘绒毛白蜡钙调素结合转录因子FvCAMTA1的互作蛋白，为解析其抗盐性机制奠定基础。【方法】采用酵母双杂交技术对其互作蛋白进行探究，提取绒毛白蜡‘盐蜡’新品种幼苗的总RNA，利用SMART技术合成ds cDNA，依据FvCAMTA1基因的CDS序列设计引物，通过PCR扩增出FvCAMTA1基因的编码序列(约2 700 bp)，构建重组诱饵载体pGBKT7-FvCAMTA1转化酵母菌株Y2HGold，并在缺陷型培养基上检测诱饵载体的毒性与自激活活性，筛选与绒毛白蜡钙调素结合转录因子FvCAMTA1互作的猎物蛋白，对部分互作蛋白进行了回补验证，并对互作的猎物蛋白进行Gene Ontology(GO)注释分析。【结果】成功构建了受盐诱导的绒毛白蜡全株幼苗的cDNA酵母双杂交文库，文库滴度为4.58×109CFU·mL~(-1)，插入片段长度为250～2 000 bp，重组率为100%。经检测诱饵载体无法自我激活也无毒性，所筛选的猎物蛋白经测序和Blast比对分析，并对其进行了共转验证，分离得到相互作用的46个阳性克隆。GO注释显示互作蛋白参与生物过程有11种，分子功能7种，细胞组分12种。研究结果补充和完善了FvCAMTA1的信号传递途径，为进一步研究绒毛白蜡钙调素结合转录因子FvCAMTA1及其共生互作蛋白的作用机制提供了新的分子证据。【结论】成功构建了绒毛白蜡酵母双杂交文库，为鉴定FvCAMTA1的互作蛋白并解析抗盐机理研究提供了重要理论依据。

【目的】绒毛白蜡是重要的盐碱地造林树种,挖掘绒毛白蜡的耐盐潜力,对推动黄河流域盐碱地生态保护和修复具有重要意义。CAMTA是植物抗逆胁迫信号通路中的重要转录激活因子,但绒毛白蜡盐胁迫信号途径中包括FvCAMTA1在内的大部分关键基因,尚未被克隆与鉴定,与FvCAMTA1发生互作的蛋白也不清楚,严重阻碍绒毛白蜡抗盐分子机理研究的瓶颈。本研究挖掘绒毛白蜡钙调素结合转录因子FvCAMTA1的互作蛋白,为解析其抗盐性机制奠定基础。【方法】采用酵母双杂交技术对其互作蛋白进行探究,提取绒毛白蜡‘盐蜡’新品种幼苗的总RNA,利用SMART技术合成ds cDNA,依据FvCAMTA1基因的CDS序列设计引物,通过PCR扩增出FvCAMTA1基因的编码序列(约2 700 bp),构建重组诱饵载体pGBKT7-FvCAMTA1转化酵母菌株Y2HGold,并在缺陷型培养基上检测诱饵载体的毒性与自激活活性,筛选与绒毛白蜡钙调素结合转录因子FvCAMTA1互作的猎物蛋白,对部分互作蛋白进行了回补验证,并对互作的猎物蛋白进行Gene Ontology(GO)注释分析。【结果】成功构建了受盐诱导的绒毛白蜡全株幼苗的cDNA酵母双杂交文库,文库滴度为4.58×109CFU·mL-1,插入片段长度为250～2 000 bp,重组率为100%。经检测诱饵载体无法自我激活也无毒性,所筛选的猎物蛋白经测序和Blast比对分析,并对其进行了共转验证,分离得到相互作用的46个阳性克隆。GO注释显示互作蛋白参与生物过程有11种,分子功能7种,细胞组分12种。研究结果补充和完善了FvCAMTA1的信号传递途径,为进一步研究绒毛白蜡钙调素结合转录因子FvCAMTA1及其共生互作蛋白的作用机制提供了新的分子证据。【结论】成功构建了绒毛白蜡酵母双杂交文库,为鉴定FvCAMTA1的互作蛋白并解析抗盐机理研究提供了重要理论依据。

【目的】利用酵母双杂交系统在感病番茄中蔬四号中筛选分别与AvrPto、AvrPtoB互作的蛋白,研究AvrPto、AvrPtoB作为毒性因子在感病番茄中的作用通路。【方法】提取感病番茄中蔬四号的总RNA,合成中蔬四号cDNA文库,分别构建AvrPto和AvrPtoB的诱饵载体,从中蔬四号cDNA文库中筛选分别与AvrPto、AvrPtoB互作的蛋白,并对阳性克隆进行分析和鉴定。【结果】最终筛选到7个与AvrPto互作的蛋白,2个与AvrPtoB互作的蛋白,核酮糖-1,5-二磷酸(RuBP)羧化酶/加氧酶小亚基和AvrPto、AvrPtoB都能够互作,说明AvrPto、AvrPtoB参与破坏植物...

为研究WSSV的粘附蛋白VP37相关蛋白的基因,应用酵母双杂交系统Ⅲ筛选中国明对虾(Fenneropenaeus chinensis)鳃细胞全长cDNA文库。构建VP37 基因的重组载体PGBKT7 VP37,把它转化酵母Y187后与含文库质粒的酵母AH109配合,在营养缺陷培养基上进行双杂交筛选。经过PCR鉴定确定了1个阳性克隆。测定该段cDNA序列并进行生物信息学分析,结果显示,此cD NA片段编码的蛋白与蛋白酶的同源性较高,该蛋白在WSSV识别并结合宿主的过程中所起的作用还有待于进一步研究。成功筛选了VP37相关蛋白的cDNA片段,为研究WSSV入侵以及感染致病的机制等方面提供了新线索。

[目的]从番木瓜4个不同成熟期果实的转录组中筛选并克隆得到1个转录因子CpMYB114L,构建番木瓜果实的cDNA文库,筛选与CpMYB114L互作的蛋白,探究CpMYB114L参与调控果实成熟的分子机理。[方法]以番木瓜‘GZBG’品种的果实为材料,设计特异引物,克隆CpMYB114L CDS区,利用生物信息学软件分析该基因序列及其编码的蛋白序列。提取番木瓜不同成熟期果实的总RNA,利用all-direct法建立酵母双杂交cDNA文库。构建pGBKT7-CpMYB114L诱饵载体,对其自激活检测后,通过共转化从文库中筛选CpMYB114L互作蛋白。通过在NCBI网站上进行序列比对,明确互作蛋白的功能分类,最后对各类蛋白基因在番木瓜不同成熟期果实中的表达进行分析。[结果]CpMYB114L基因的CDS序列编码227个氨基酸,预测其相对分子质量为26 304.3,理论等电点为6.23,亲水性总平均值为-0.893。CpMYB114L蛋白序列与甜樱桃(PaWERL)、蒺藜苜蓿(MtMYB1)、黧豆(MpMYB113)、大豆(GmMYB1)和苹果(MdMYB308L)的同源性较近。cDNA文库总库容为1.15×10~7 CFU,重组率100%,插入片段长度为750～2 000 bp。诱饵载体pGBKT7-CpMYB114L不存在自激活。从酵母双杂交文库中筛选到30个初始阳性克隆,经回转验证后最终获得26个与CpMYB114L互作的蛋白,共分为4类,包括乙烯响应受体1(CpERS1)、酰基辅酶A硫酯酶13(CpAcots13)、热休克蛋白42(CpHSP42)和叶绿体转运子159 (CpTOC159)。在果实成熟过程中,CpERS1和CpHSP42表达量先上升后下降,CpAcots13表达量持续上升,CpTOC159表达量剧增后趋于平稳。[结论]推测CpMYB114L与CpERS1蛋白互作参与番木瓜果实成熟的调控。

[目的]本文旨在鉴定香蕉果实后熟关键调控因子MaMADS2的互作蛋白，深入解析MaMADS2影响香蕉果实后熟过程的分子机制。[方法]以MaMADS2为诱饵利用酵母双杂交文库获得候选互作蛋白，通过克隆候选互作基因编码区进行点对点酵母双杂交试验来验证互作情况；利用转录组学分析互作蛋白相关基因在后熟过程中的表达情况；利用双分子荧光互补试验鉴定重要互作蛋白与MaMADS2的互作；最后用蛋白免疫印迹分析MaMADS2蛋白在香蕉后熟过程中的表达。[结果]成功构建了果实在乙烯利催熟下的cDNA文库，初级和次级文库的库容分别为2.9×10~6和3.2×10~6 CFU·mL~(-1),平均插入片段大小在1 200 bp以上，可满足后续酵母双杂交筛选的要求。最终共鉴定出7个互作蛋白，其中有2个MADS-box转录因子，3个E3泛素连接酶，2个具有转录抑制作用的蛋白。转录组数据表明，乙烯利可抑制2个MADS-box基因的表达，而1-甲基环丙烯(1-MCP)对其表达起诱导作用。双分子荧光互补试验表明，MaMADS2与MADS-box转录因子Ma04＿p30020.1存在互作关系。蛋白免疫印迹分析显示，MaMADS2在后熟过程中蛋白水平逐渐降低，这与其可以和E3泛素连接酶互作是一致的。[结论]通过构建高质量的果实cDNA文库与酵母双杂交筛库技术，鉴定出多个与MaMADS2互作的蛋白，并明确了MaMADS2与另一MADS-box转录因子Ma04＿p30020.1之间存在明显的互作关系。

对虾白斑综合征病毒(WSSV)开放阅读框wsv112编码脱氧尿苷焦磷酸酶(dUTP pyrophosphatase,dUTPase)。为研究wsv112与宿主的互作关系,本研究采用酵母双杂交Gal4系统从凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)肠道cDNA文库中筛选与wsv112互作的候选蛋白。以WSSV为模板,构建pGBKT7-112诱饵载体,转化到Y2H Gold酵母菌感受态细胞中,转化菌液涂布到不同缺陷型培养基上,检测诱饵载体的自激性和毒性。将凡纳滨对虾肠道cDNA文库与诱饵菌株pGBKT7-112接合,通过筛选力度不同的缺陷型培养基、颜色反应、PCR、测序鉴定等步骤筛选阳性克隆,将阳性菌株提取质粒,再经过回复杂交实验验证筛选出的阳性质粒与诱饵载体的作用。研究表明,诱饵载体pGBKT7-112无自激性和毒性,可用于酵母双杂交实验;经初筛和回复杂交实验最终得到2个阳性质粒,经过NCBI数据库对比,其编码的蛋白分别与日本囊对虾(Penaeus japonicus)C型凝集素(AGW27416.1)和克氏原螯虾(Procambarus clarkii)40S核糖体蛋白S20小亚基蛋白(ALE99171.1)具有37%和98%同源性。本研究为wsv112的调控机制提供新的线索。

【目的】草莓镶脉病毒(Strawberry vein banding virus,SVBV)是侵染草莓的主要病毒,但其侵染草莓的机制尚不清楚。论文以SVBV的P6蛋白为诱饵筛选森林草莓(Fragaria vesca)c DNA文库的寄主因子,为解析SVBV侵染草莓的分子机制提供理论依据。【方法】SVBV接种森林草莓,提取出现明显症状叶片的总RNA,Dnase I处理后,用SMART法反转录合成ds c DNA,均一化处理c DNA并酶切纯化,将1 kb,表明森林草莓c DNA文库符合试验标准。最终利用SD

[目的]本文旨在使用“Mate＆Plate”技术构建簇毛麦受白粉菌诱导的酵母双杂交文库，鉴定正向调节小麦白粉病抗性的簇毛麦E3泛素连接酶蛋白CMPG1-V的互作蛋白，为解析其抗病性机制奠定基础。[方法]提取白粉菌诱导前及诱导后1、2、4、6、12、24和48 h的簇毛麦叶片总RNA，利用SMART技术分离纯化mRNA，合成ds cDNA，将ds cDNA和pGADT7-Rec载体共同转入酵母菌株Y187，构建簇毛麦酵母双杂交文库，明确文库插入片段大小和滴度。以CMPG1-V为诱饵筛库，并对部分互作蛋白进行了回补验证，利用BiFC方法验证CMPG1-V与筛选到的一个互作蛋白CMIN6（MYB25-V）的体内互作。[结果]成功构建了受白粉菌诱导的簇毛麦叶片酵母双杂交文库，文库滴度为9.5×10~(7 )CFU·mL~(-1)，插入片段长度在250～2 000 bp之间，重组率为100%。以CMPG1-V为诱饵筛选文库，获得79个互作蛋白，挑选其中10个互作蛋白进行回补验证。通过BiFC实验验证了CMPG1-V与MYB25-V的体内互作。MYB25-V及其在小麦中的同源基因TaMYB25受白粉菌诱导后均上调表达，推测MYB25-V可能参与调控小麦白粉病抗性。[结论]本研究成功构建了白粉菌诱导的簇毛麦酵母双杂交文库，为鉴定CMPG1-V的互作蛋白并解析其抗病性机制奠定了基础。

【目的】利用酵母双杂交系统研究与猪Calsarcin-1相互作用的蛋白,了解Calsarcin-1在猪骨骼肌纤维类型形成和信号通路的调控功能。【方法】首先用长白猪Calsarcin-1基因构建既无自激活性又无毒性的pGBKT7-CS1诱饵载体;然后从猪的骨骼肌组织样中提取mRNA,利用SMART技术合成并纯化双链cDNA;最后通过酵母双杂交系统的共转化法筛选与Calsarcin-1相互作用的蛋白,在GenBank中比对分析相互作用基因,分析Calsarcin-1在骨骼肌中的功能。【结果】构建了pGBKT7-CS1诱饵载体,获得具有完整3′端的猪骨骼肌单链cDNA,并合成双链cDNA。筛选出4个...

【目的】筛选介体灰飞虱(Laodelphax striatellus,SBPH)中与水稻条纹病毒(RSV)病害特异蛋白(disease-specific protein,SP)可能发生相互作用的蛋白质,为明确介体灰飞虱传播RSV的分子机制及SP在传毒过程中的作用打下基础。【方法】提取高质量灰飞虱总RNA并通过TaKaRa D9086 OligtexTM-dT30 mRNA Purification Kit对mRNA进行纯化。利用SMART技术合成双链cDNA,利用Axygen的PCR纯化回收试剂盒将ds cDNA回收纯化,纯化后的ds cDNA再经SfiⅠ限制性内切酶处理纯化后与文库载体pPR...