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[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
刘双 陈沼汀 董昭旭 孙国旭 李晖 关淑艳
【目的】从野生型拟南芥中克隆抗寒基因ICE1,通过农杆菌介导法将ICE1基因转到烟草中,对其功能进行研究。【方法】以三叶一心期拟南芥幼苗为材料,提取其总RNA,通过RT-PCR扩增得到ICE1基因的完整开放阅读框序列;构建以抗除草剂Bar基因为筛选标记的植物表达载体pCAMBIA3301-ICE1,通过农杆菌介导法转入到烟草中,对阳性植株进行PCR检测和生理生化指标测定,并对ICE1基因在转基因烟草植株中的表达特征进行分析。【结果】成功克隆了拟南芥抗寒基因ICE1,其完整开放阅读框长1 485bp。系统进
关键词：
ICE1基因 植物表达载体 耐寒性
[期刊] 华北农学报
[作者]
郭坤元 张欣欣
为了研究拟南芥核酸酶AtCaN2基因在植物生长发育过程中的作用与功能,从拟南芥中克隆了核酸酶AtCaN2基因,并对该基因进行生物信息学分析,亚细胞定位分析,蛋白质诱导、表达、纯化及功能研究。结果表明,AtCaN2蛋白等电点为8.45,化学式为C_(1116)H_(1788)N_(310)O_(335)S_3,共含有3 552个原子数,为亲水性蛋白;AtCaN2与十字花科亚麻荠的同源性较高,同源性为87.89%,与谷子、高粱和玉米的同源性较低,同源性分别是56.42%,57.35%,56.47%,且在氨基酸序列中间具有高度保守的D-X-D序列;同时进化树分析显示AtCaN2与十字花科亚麻荠的亲缘性最近,与谷子、玉米等禾本科植物的亲缘性比较远,这些结果同氨基酸序列比对的结果一致;亚细胞定位结果显示其定位于细胞质,与预测结果相符;蛋白质诱导和纯化得到大小约为35 ku的His-AtCaN2融合蛋白;Western Blot分析显示,诱导表达的融合蛋白正确翻译表达,且没有出现结构上的断裂或者降解的情况;小量诱导和大量诱导均有点突变后的His-AtCaN2(M)融合蛋白表达,且纯化后得到了点突变His-AtCaN2(M)较单一的条带;蛋白酶活性分析表明,His-AtCaN2融合蛋白对核酸底物具有降解能力,表现出较高的活性,而His-AtCaN2(M)点突变融合蛋白对核酸底物没有降解能力,底物基本上未降解。研究结果可以为下一步在植物体内研究AtCaN2基因的相关机理作用提供基础。
[期刊] 湖南农业大学学报(自然科学版)
[作者]
朱兆海 洪亚辉 夏石头 萧浪涛
以拟南芥为研究对象,根据已知的生物信息数据,通过反向遗传学的方法,对与钴胺素合成相关蛋白CSRP基因进行分子克隆,得到该基因的基因组序列和cDNA序列,构建二元重组质粒,利用根癌农杆菌介导的花浸泡转基因方法分别转化突变体和野生型植株,进行互补试验和过表达试验,筛选转基因植株,并进一步预测其编码蛋白的亚细胞定位于叶绿体中.结果表明,在突变体中转入该基因后,转基因植株恢复野生型的表型,而在过表达的转基因植株中表型更为明显,即生长旺盛,晚花.说明该基因对于拟南芥的营养生长起促进作用,由于其功能预测与钴胺素合成相关的蛋白,推测其可能在植物营养生长中起作用.
[期刊] 华北农学报
[作者]
杜亚琳 陈海燕 郝宁 藤原徹 武涛
为了了解Mo的分子功能,对26 000粒拟南芥EMS诱变突变体种子进行了筛选,鉴定出一个对正常Mo敏感的突变体4-10。在正常170 nmol/L Mo条件下,4-10突变体的根部伸长发育受到抑制,而340μmol/L Mo处理能部分恢复突变体根长。在170 nmol/L Mo条件下4-10和Col-0幼苗的根长分别为(1.56±0.13)cm和(11.89±0.71)cm;而在340μmol/L Mo条件下,4-10和Col-0的根长分别为(3.3±0.17)cm和(6.8±0.73)cm。此外,340μmol/L Mo处理能够恢复4-10异常的根形态。Mo含量测定结果表明,4-10突变体植株根部Mo含量显著低于野生型植株;除了对正常Mo敏感外,4-10突变体叶色对NH_4~+也敏感,其花青素含量显著高于Col-0。为了鉴定4-10突变体候选基因,利用图位克隆技术将候选基因定位到1号染色体一个23 kb区域(26.809~26.832 Mb),进一步基因组重测序结果表明,在该区域存在1个非同义突变SNP,包含该SNP的基因At1g71100编码核糖-5-磷酸异构酶(RPI),初步证明,RPI基因为4-10突变体的候选基因。利用At RPI基因纯合突变植株和4-10突变体进行的等位性检测结果表明,4-10突变体和等位基因突变体rsw10-1杂交的F1仍然对NH_4~+敏感,从而确定RPI基因为4-10突变体基因。通过表型分析注意到除了过量Mo能恢复4-10突变体根长之外,外源尿苷处理同样可以恢复4-10突变体的根长。结果表明,过量的Mo通过尿苷转运作用促进了补救合成途径进程。
[期刊] 福建农林大学学报(自然科学版)
[作者]
陈晓婷 孙翠霞 王爱荣 鲁国东
以拟南芥基因组DNA为模板,扩增出细胞色素P450(CYP76C2)基因的ORF,成功构建了CYP76C2基因的过表达载体并获得转基因植株.通过离体和活体接种表明,CYP76C2基因的过表达植株对核盘菌的抗性增强.
关键词：
拟南芥 细胞色素P450 菌核病 草酸
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
瓮巧云 邢继红 董金皋
生物技术的快速发展为植物抗病基因的克隆奠定了坚实的基础。克隆抗病基因不但有利于深入研究植物与病原物的分子互作机理,而且为植物重要病害的防治提供了有效措施。迄今为止,在拟南芥中已经克隆了十几个抗病基因。对拟南芥抗病基因的种类和特性、克隆策略以及克隆抗病基因的应用前景进行了综述。详细介绍了定位克隆技术和转座子标签技术的原理及其在拟南芥抗病基因克隆中的应用。
[期刊] 浙江农林大学学报
[作者]
李丹丹 林蓉 李新国 郑月萍
【目的】茉莉酰氨基酸结合物合成酶(jasmonoyl amino acid conjugate synthase,JAR1)可以催化茉莉酸(jasmonic acid,JA)形成茉莉酸的活性形式茉莉酸异亮氨基酸复合体(jasmonic acid-isoleucine,JA-Ile)，从而激活JA信号途径。JA信号途径在介导植物盐胁迫的响应中发挥重要作用，因此，探究AtJAR1在植物耐盐性中的功能对于研究JA信号途径影响植物耐盐性的机制具有重要作用。【方法】运用CRISPR/Cas9基因编辑技术，创建了2个不同的拟南芥Arabidopsis thaliana AtJAR1基因突变体，并对这2个突变体进行地上部生物量的统计分析和JA信号标记基因的表达分析，以确定AtJAR1基因功能缺失。之后，观察分析不同浓度氯化钠和脱落酸(ABA)处理对jar1突变体的种子萌发和幼苗建成的影响，明确AtJAR1基因对拟南芥耐盐性的影响。最后，通过比较分析盐处理前后野生型和突变体的钾离子(K~+)和钠离子(Na~+)质量摩尔浓度，以及高亲和力K~+转运蛋白基因AtHAK5的表达变化情况，初步探究AtJAR1基因在拟南芥耐盐性中的功能。【结果】JA信号标记基因AtVSP1和AtVSP2的表达量大幅下调，表明AtJAR1基因功能丧失。与点突变产生的jar1#1突变体不同的是，这2个突变体表现为前3周生长加快，之后逐渐减缓并出现叶片萎蔫的表型。同时，AtJAR1突变可以缓解盐胁迫和ABA对种子萌发和根系生长产生的抑制作用。此外，盐胁迫下AtJAR1突变可以促进AtHAK5的表达和根系对K~+的吸收转运。【结论】JA信号途径可能通过与ABA交互作用影响AtHAK5的表达量，以调节植物根系对K~+的吸收转运，进而改变细胞内K~+/Na~+平衡，最终影响植物耐盐性。图8表2参52
[期刊] 福建农林大学学报(自然科学版)
[作者]
黄幼梅 柴梦楠 席鑫鹏 朱文辉 齐金岗 秦源 蔡汉阳
EPF/EPFL基因家族成员编码一类富含半胱氨酸的分泌型小肽，本研究通过实时荧光定量PCR检测、核盘菌接种和二氨基联苯胺(DAB)染色分析11个EPF/EPFL基因在拟南芥对核盘菌防御反应中的作用.荧光定量PCR分析显示，接种核盘菌后，EPFL1、EPFL2、EPFL3、EPFL4、EPFL5、EPFL6和EPFL9的表达水平至少在一个时间点明显上调.核盘菌接种处理后，epfl1、epfl2、epfl3、epfl4、epfl5、epfl6和epfl9拟南芥单突变体叶片的病斑面积与野生型拟南芥(WT)相似，且DAB染色显示的H_2O_2含量也与WT没有明显的差别；epfl1,2,4,6四突变体拟南芥叶片的病斑面积明显大于WT.DAB染色结果显示，与WT相比，epfl1,2,4,6四突变体拟南芥的H_2O_2含量明显增多.荧光定量PCR结果进一步显示，与WT相比，核盘菌抗病相关基因YDDs在epfl1,2,4,6四突变体拟南芥接种核盘菌前后的表达量均明显下调.这说明EPFL1、EPFL2、EPFL4和EPFL6在拟南芥应答核盘菌的防御反应过程中存在冗余功能，通过介导YDDs基因的表达，共同调控植物免疫反应.
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
蒋琦 王倩
【目的】分析拟南芥xtc1突变体茎部表皮蜡的组分和含量,并鉴定导致xtc1突变体表型的基因。【方法】通过气相色谱法分析拟南芥xtc1突变体与Ler野生型茎部表皮蜡的成分;利用图位克隆确定突变基因位点,通过在拟南芥xtc1突变体中过量表达FATB基因,验证突变位点与FATB基因的关系。【结果】拟南芥xtc1突变体茎部表皮蜡总量约为Ler野生型的1/3,且各组分含量均明显减少;将突变基因定位在第1染色体顶端物理距离为80kb的2个标记T27G7-3和F22O13-1之间,该区域含有21个基因。T-DNA插入突变体观察及测序分析表明,xtc1突变体在At1g08510(FATB)基因的第1个外显子上...
关键词：
表皮蜡 FATB 图位克隆 拟南芥
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
郭佳 郁品泽 贾敏 郁飞
[目的]制备乙烯应答基因HLS1多克隆抗体,在过表达植物中检测HLS1的积累,为深入研究HLS1响应乙烯信号通路的分子机制奠定基础。[方法]构建pET28a-HLS1c原核表达载体,转化到大肠杆菌BL21(DE3)中,用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导获得重组蛋白HLS1c-His;镍柱亲和纯化重组蛋白后免疫家兔获得抗HLS1血清,利用抗原亲和纯化抗血清获得高纯度的HLS1多克隆抗体;用HLS1抗体和GFP抗体,检测原生质体瞬时转化体系中GFP-HLS1c融合蛋白的表达;用农杆菌蘸花法获得过表达GFP-HLS1g的转基因植物,用HLS1抗体和GFP抗体检测GFP-HLS1g融合蛋白的表达。[结果]成功构建了原核表达载体pET28a-HLS1c,并在大肠杆菌系统中诱导获得重组蛋白HLS1c-His,且多以包涵体形式存在。纯化的HLS1c-His多克隆抗体,能清晰检测到约80 ng原核表达的HLS1抗原。纯化的HLS1抗体不仅能检测到原生质体中瞬时表达的GFP-HLS1c融合蛋白,也能检测到过表达转基因植物株系中的GFP-HLS1g融合蛋白,并且与标签蛋白GFP对应抗体所检测到的特异性条带大小一致。[结论]成功制备了拟南芥HLS1蛋白多克隆抗体,为HLS1蛋白在植物发育中的功能研究奠定了基础。
[期刊] 林业科学
[作者]
高志民 郑波 彭镇华
采用RT-PCR和RACE技术,从毛竹中分离到1个含完整的编码区和5′端非翻译区的cDNA,长776bp,编码240个氨基酸,命名为PeMADS1(GenBank登记号:EU327784)。序列分析表明,该基因具有典型的植物MADS-box基因结构,与拟南芥的E类功能基因AGL6编码蛋白的一致性为57.2%。将PeMADS1基因置于CaMV35S启动子控制下,构建PeMADS1基因植物表达载体。应用农杆菌介导将目的基因转入拟南芥,RT-PCR证实PeMADS1基因得到异位表达。转基因拟南芥呈现开花提早、莲座叶卷曲、发育迟缓等表型,表明PeMADS1可能参与毛竹由营养生长转向生殖生长的发育调控。
关键词：
毛竹 MADS-box基因 异位表达
[期刊] 中国农业科学
[作者]
刘凯 胡春华 杜发秀 张玉娥 魏岳荣 易干军
【目的】研究超表达拟南芥CBF1基因(AtCBF1)对大蕉抗寒性的影响,为从大蕉克隆抗寒相关基因奠定基础。【方法】采用农杆菌介导法转化东莞大蕉的胚性细胞悬浮系,获得转AtCBF1基因的大蕉植株;利用GUS组织染色、PCR、RT-PCR以及RT-qPCR对转基因植株进行鉴定;比较低温处理后的转基因株系和对照的冷害特征以及超氧化物歧化酶(SOD)活性和丙二醛(MDA)含量等生理生化指标,鉴定转基因大蕉植株的抗寒能力。【结果】试验共获得6个抗性再生转化系。GUS组织染色结果表明,除T1外,其余均为阳性;PCR鉴定结果表明,AtCBF1在6个抗性再生转化系均为阳性,而GUS基因在T1转化系中没有检测出...
[期刊] 华中农业大学学报
[作者]
詹栎 胡贞洁
以水杨酸处理后的拟南芥(Col-0)为材料,采用高通量测序技术分析拟南芥在水杨酸处理后的转录组变化,发现了12个受水杨酸下调的新基因。以Col-0幼苗的cDNA为模板克隆其中一个基因NG314,并对其功能进行研究。NG314的cDNA序列总长为1 097bp,基因组DNA包含1个内含子。荧光定量PCR结果表明,NG314的表达量随着水杨酸处理时间延长而逐渐下降,病原菌侵染也能抑制NG314的表达。NG314可能是一个长链非编码RNA或新的miRNA基因,可能通过抑制其靶基因的表达调控植物的抗病反应。
[期刊] 中国农业科学
[作者]
郝丛丛 郑会欣 贾娇 司贺龙 陈展 赵斌 张靖 邢继红 董金皋
【目的】明确拟南芥抗灰霉病基因T1N6_22在抗Pst DC3000过程中的功能,分析T1N6_22影响拟南芥对Pst DC3000的抗性原因。【方法】对t1n6_22突变体和转基因回复突变体(t1n6_22/T1N6_22)接种Pst DC3000,检测其症状;采用间苯胺蓝染色法检测接种突变体中胼胝质的积累情况;测定接种叶片中Pst DC3000的生长量,明确T1N6_22在拟南芥抗Pst DC3000过程中的功能。利用RT-PCR技术,检测SA、JA和ET对T1N6_22表达的影响及T1N6_22对抗病防御相关基因表达的影响;利用quantitative real-time PCR技术,检...
[期刊] 华中农业大学学报
[作者]
曾海洋 罗美中
为研究叶绿体血红素加氧酶HO1的生物学功能和分子作用机制,构建了拟南芥血红素加氧酶基因AtHO1的重组融合蛋白表达载体pET28a-AtHO1,质粒转化到Escherichia coli BL21(DE3)中诱导表达重组蛋白。经SDS-PAGE电泳检测,AtHO1的重组融合蛋白获得了高效表达,分子质量为28～36ku,且为可溶蛋白。重组蛋白经Ni-NTA亲和层析法纯化后,得到纯度较高的蛋白。纯化产物免疫新西兰大耳兔获得了专一识别重组蛋白6×His-AtHO1的抗血清,进一步提取拟南芥和水稻叶片总蛋白,蛋白质印迹检测显示,在分子质量28～36ku之间出现特异性条带,证明用重组蛋白6×His-At...
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