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[期刊] 华中农业大学学报
[作者]
曾海洋 罗美中
为研究叶绿体血红素加氧酶HO1的生物学功能和分子作用机制,构建了拟南芥血红素加氧酶基因AtHO1的重组融合蛋白表达载体pET28a-AtHO1,质粒转化到Escherichia coli BL21(DE3)中诱导表达重组蛋白。经SDS-PAGE电泳检测,AtHO1的重组融合蛋白获得了高效表达,分子质量为28～36ku,且为可溶蛋白。重组蛋白经Ni-NTA亲和层析法纯化后,得到纯度较高的蛋白。纯化产物免疫新西兰大耳兔获得了专一识别重组蛋白6×His-AtHO1的抗血清,进一步提取拟南芥和水稻叶片总蛋白,蛋白质印迹检测显示,在分子质量28～36ku之间出现特异性条带,证明用重组蛋白6×His-At...
[期刊] 中国农业科学
[作者]
胡骁飞 魏凤仙 邢广旭 职爱民 柴书军 孙亚宁 王磊 邓瑞广 张改平
【目的】制备灵敏性高、特异性强的植酸酶多克隆抗体。【方法】将初步纯化的麸皮植酸酶蛋白经凝胶电泳鉴定纯度后,按50μg蛋白/只.次免疫Balb/C小鼠,共免疫4次,每次间隔4周,最后一次免疫60 d后,摘眼球取血,制备抗血清。利用间接ELISA方法测定抗血清效价,间接竞争ELISA测定敏感性和特异性。【结果】凝胶电泳的麸皮植酸酶只有一个条带;血清植酸酶抗体效价达1×104;半数抑制浓度达148.87 ng.mL-1。此抗血清对市售的普通微生物植酸酶、市售包被微生物植酸酶及浓缩的微生物植酸酶的半数抑制浓度分别达到165.59、163.80和166.51 ng.mL-1,交叉反应率分别为89.85%...
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
郭佳 郁品泽 贾敏 郁飞
[目的]制备乙烯应答基因HLS1多克隆抗体,在过表达植物中检测HLS1的积累,为深入研究HLS1响应乙烯信号通路的分子机制奠定基础。[方法]构建pET28a-HLS1c原核表达载体,转化到大肠杆菌BL21(DE3)中,用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导获得重组蛋白HLS1c-His;镍柱亲和纯化重组蛋白后免疫家兔获得抗HLS1血清,利用抗原亲和纯化抗血清获得高纯度的HLS1多克隆抗体;用HLS1抗体和GFP抗体,检测原生质体瞬时转化体系中GFP-HLS1c融合蛋白的表达;用农杆菌蘸花法获得过表达GFP-HLS1g的转基因植物,用HLS1抗体和GFP抗体检测GFP-HLS1g融合蛋白的表达。[结果]成功构建了原核表达载体pET28a-HLS1c,并在大肠杆菌系统中诱导获得重组蛋白HLS1c-His,且多以包涵体形式存在。纯化的HLS1c-His多克隆抗体,能清晰检测到约80 ng原核表达的HLS1抗原。纯化的HLS1抗体不仅能检测到原生质体中瞬时表达的GFP-HLS1c融合蛋白,也能检测到过表达转基因植物株系中的GFP-HLS1g融合蛋白,并且与标签蛋白GFP对应抗体所检测到的特异性条带大小一致。[结论]成功制备了拟南芥HLS1蛋白多克隆抗体,为HLS1蛋白在植物发育中的功能研究奠定了基础。
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
王玥 梁爽 梁慧珂 郁飞 齐亚飞
【目的】将拟南芥叶绿体发育必需蛋白ＰＡＣ进行大肠杆菌原核表达和纯化，并免疫家兔，获得针对ＰＡＣ蛋白的多克隆特异性抗体，为进一步研究ＰＡＣ蛋白在叶绿体发育中的功能提供保证。【方法】将编码拟南芥ＰＡＣ蛋白的ＣＤＮＡ克隆至原核表达载体ＰＥＴ－２８Ａ中，转化ＢＬ２１（ＤＥ３）表达菌，经ＩＰＴＧ诱导后，对诱导产生的ＰＡＣ蛋白进行镍柱亲和纯化和ＳＤＳ－ＰＡＧＥ割胶纯化，并将纯化的ＰＡＣ蛋白通过皮下注射免疫家兔，利用分离得到的抗血清，针对拟南芥野生型、ＰＡＣ敲除突变系ＰＡＣ－１和ＰＡＣ过表达系ＰＡＣＯＥ的总蛋白进行免疫印迹检测。【结果】成功构建了拟南芥基因ＰＡＣ的原核表达载体ＰＥＴ－２８Ａ－ＰＡＣ，在３７℃．．．
关键词：
叶绿体 PAC蛋白 原核表达 抗体制备
[期刊] 华中农业大学学报
[作者]
杜娜 顾泽茂 袁军法 林蠡 翟艳花 刘学芹 罗宇良
根据GenBank中致病性嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)气溶素(aerolysin,Aer)基因的序列设计引物,以来自湖北的鱼源A.hydrophila分离株为模板扩增出aer基因的ORF序列,克隆到pMD18-T载体上进行序列测定。测序结果表明,A.hydrophila的aer基因的系统进化树中国内菌株聚为一支,国外菌株聚为一支。通过pET-32a(+)载体构建Ah15株aer基因的表达载体pET32a-15,转化大肠杆菌BL21(DE3)pLysS中进行诱导表达,通过SDS-PAGE分析,显示与预期大小约72.2ku相吻合的融合蛋白带,且以包涵体形式存在。浓缩后的...
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
刘双 陈沼汀 董昭旭 孙国旭 李晖 关淑艳
【目的】从野生型拟南芥中克隆抗寒基因ICE1,通过农杆菌介导法将ICE1基因转到烟草中,对其功能进行研究。【方法】以三叶一心期拟南芥幼苗为材料,提取其总RNA,通过RT-PCR扩增得到ICE1基因的完整开放阅读框序列;构建以抗除草剂Bar基因为筛选标记的植物表达载体pCAMBIA3301-ICE1,通过农杆菌介导法转入到烟草中,对阳性植株进行PCR检测和生理生化指标测定,并对ICE1基因在转基因烟草植株中的表达特征进行分析。【结果】成功克隆了拟南芥抗寒基因ICE1,其完整开放阅读框长1 485bp。系统进
关键词：
ICE1基因 植物表达载体 耐寒性
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
瓮巧云 邢继红 董金皋
生物技术的快速发展为植物抗病基因的克隆奠定了坚实的基础。克隆抗病基因不但有利于深入研究植物与病原物的分子互作机理,而且为植物重要病害的防治提供了有效措施。迄今为止,在拟南芥中已经克隆了十几个抗病基因。对拟南芥抗病基因的种类和特性、克隆策略以及克隆抗病基因的应用前景进行了综述。详细介绍了定位克隆技术和转座子标签技术的原理及其在拟南芥抗病基因克隆中的应用。
[期刊] 华北农学报
[作者]
职爱民 刘庆堂 李青梅 杨苏珍 胡骁飞 柴书军 邓瑞广 张改平
拟合成并鉴定西马特罗(Cimaterol,CIM)人工抗原,通过动物免疫生产亲和力高、特异性好的鼠源CIM多克隆抗血清。通过重氮化方法将西马特罗偶联于载体蛋白BSA和OVA上,分别合成免疫抗原BSA-CIM和包被抗原OVA-CIM,并采用紫外分光光度法和SDS-PAGE进行了鉴定。结果表明,半抗原CIM和载体蛋白偶联成功。动物免疫试验结果显示,6只小鼠效价均达1×10-3以上,且4号小鼠多抗血清抗CIM的IC50为86.9ng/mL,表明成功获得了高效价、特异性好、亲和力高的的鼠源抗CIM多抗血清。
关键词：
西马特罗 人工抗原 合成 多抗血情
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
周亚媚 梁爽 齐亚飞 刘夏燕
[期刊] 华中农业大学学报
[作者]
张苗苗 陶章生 陈婷婷 夏涛 彭良才 丰胜求
纤维素合酶是参与纤维素-β1,4-葡聚糖链延伸的主要催化亚基,为进一步研究水稻中纤维素合酶的作用机理,采用DNA重组技术,将纤维素合酶基因CesA1、CesA2、CesA3克隆入表达载体pGEX-4T-3,构建重组质粒。在大肠杆菌JM109中,经异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导后在原核细胞中成功表达了3种纤维素合酶的融合蛋白,通过谷胱甘肽巯基转移酶(GST)纯化系统获得融合蛋白,以此作为抗原免疫家兔,制备出效价高、特异性强的多克隆抗体。
关键词：
水稻 纤维素合酶 融合蛋白 多克隆抗体
[期刊] 华北农学报
[作者]
郭坤元 张欣欣
为了研究拟南芥核酸酶AtCaN2基因在植物生长发育过程中的作用与功能,从拟南芥中克隆了核酸酶AtCaN2基因,并对该基因进行生物信息学分析,亚细胞定位分析,蛋白质诱导、表达、纯化及功能研究。结果表明,AtCaN2蛋白等电点为8.45,化学式为C_(1116)H_(1788)N_(310)O_(335)S_3,共含有3 552个原子数,为亲水性蛋白;AtCaN2与十字花科亚麻荠的同源性较高,同源性为87.89%,与谷子、高粱和玉米的同源性较低,同源性分别是56.42%,57.35%,56.47%,且在氨基酸序列中间具有高度保守的D-X-D序列;同时进化树分析显示AtCaN2与十字花科亚麻荠的亲缘性最近,与谷子、玉米等禾本科植物的亲缘性比较远,这些结果同氨基酸序列比对的结果一致;亚细胞定位结果显示其定位于细胞质,与预测结果相符;蛋白质诱导和纯化得到大小约为35 ku的His-AtCaN2融合蛋白;Western Blot分析显示,诱导表达的融合蛋白正确翻译表达,且没有出现结构上的断裂或者降解的情况;小量诱导和大量诱导均有点突变后的His-AtCaN2(M)融合蛋白表达,且纯化后得到了点突变His-AtCaN2(M)较单一的条带;蛋白酶活性分析表明,His-AtCaN2融合蛋白对核酸底物具有降解能力,表现出较高的活性,而His-AtCaN2(M)点突变融合蛋白对核酸底物没有降解能力,底物基本上未降解。研究结果可以为下一步在植物体内研究AtCaN2基因的相关机理作用提供基础。
[期刊] 林业科学
[作者]
高志民 郑波 彭镇华
采用RT-PCR和RACE技术,从毛竹中分离到1个含完整的编码区和5′端非翻译区的cDNA,长776bp,编码240个氨基酸,命名为PeMADS1(GenBank登记号:EU327784)。序列分析表明,该基因具有典型的植物MADS-box基因结构,与拟南芥的E类功能基因AGL6编码蛋白的一致性为57.2%。将PeMADS1基因置于CaMV35S启动子控制下,构建PeMADS1基因植物表达载体。应用农杆菌介导将目的基因转入拟南芥,RT-PCR证实PeMADS1基因得到异位表达。转基因拟南芥呈现开花提早、莲座叶卷曲、发育迟缓等表型,表明PeMADS1可能参与毛竹由营养生长转向生殖生长的发育调控。
关键词：
毛竹 MADS-box基因 异位表达
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
刘伟 郭抗抗 林鸷 盛洁 赵娣 赵紫印 张彦明
【目的】克隆猪Jiv蛋白核心区的2 112bp的基因片段,构建其原核表达载体后进行蛋白的表达和纯化,制备抗猪Jiv蛋白的多克隆抗体。【方法】利用RT-PCR方法,从猪脾脏组织RNA中扩增得到猪Jiv基因,将其克隆到pMD19-T载体并测序,以此为基础构建原核表达载体pET32a-Jiv,转化E.coli Rosetta(DE3)感受态细胞中,利用IPTG诱导表达,获得大量包涵体形式的猪Jiv融合蛋白。通过镍离子螯合层析柱对表达的目的蛋白进行纯化,对纯化后的包涵体蛋白进行透析复性,以每只新西兰白兔400μg蛋白的初次免疫剂量和500μg蛋白的加强免疫剂量进行免疫,共免疫5次,采集血清,采用间接E...
[期刊] 华中农业大学学报
[作者]
江学斌 马苗鹏 肖淑君 司徒嘉欣 杨军 施巨清 蔡海明 张玲华
根据GenBank中猪SIRT1mRNA序列设计引物,使用杜大长商品猪大脑RNA经RT-PCR扩增得到猪SIRT1基因全长表达序列,通过Ω-PCR将SIRT1蛋白末端抗原表位序列插入载体pET-28a(+),在大肠杆菌中表达并纯化得到45ku大小的蛋白,以其免疫新西兰大白兔并制备出抗体滴度达212的多克隆抗体。结果表明,成功制备出可以特异性识别猪SIRT1蛋白的抗体。
关键词：
猪 SIRT1 PCR 多克隆抗体
[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
喻德跃 F.Quigley R.Mache
报道了从模式植物拟南芥花ｃ Ｄ Ｎ Ａ 文库中分离鉴定的一个克隆。该ｃ Ｄ Ｎ Ａ 的长度为 ８８７ ｂｐ，其编译的蛋白质推断为２６８ ａａ（氨基酸），与大豆营养贮藏蛋白（ Ｖ Ｓ Ｐ）的同源率达 ５０％ 。 Ｎｏｒｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔ 分析表明，该基因在拟南芥叶片中仅有微量表达，但在花蕾、幼荚及茎中表达量丰富。采用发育后期的花为材料进行原位杂交，发现该基因的表达仅限制于子房壁。
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