为了在大肠杆菌中表达抗鹅细小病毒(GPV) NS1蛋白单克隆抗体轻链可变区(VL)和重链可变区(VH)基因,并测定其与NS1蛋白结合活性。对抗GPV NS1蛋白单克隆抗体VL、VH基因核苷酸序列依据大肠杆菌偏爱密码子进行优化,人工合成获得了含有可变区基因的重组质粒pUC57-VL和pUC57-VH。然后用Bam HⅠ/XhoⅠ双酶切pUC57-VL、pUC57-VH,回收340 bp的VL基因和370 bp的VH基因。目的基因通过Bam HⅠ/XhoⅠ多克隆位点分别插入至原核表达载体pET-32a,获得重组质粒pET-VL和pET-VH。重组质粒经Bam HⅠ单酶切和Bam HⅠ/XhoⅠ双酶切及测序鉴定。重组质粒分别转化大肠杆菌Rosetta(DE3),经IPTG诱导,获得了重组蛋白TRX-VL和TRX-VH的表达,分子量分别为30.3,31.4 ku。纯化后的重组蛋白能与His标签单克隆抗体发生特异性结合,鉴定结果表明,获得的纯化蛋白为目的蛋白。间接ELISA分析表明,0.4μg的TRX-VH可与25 ng的GST-NS1蛋白特异性结合而0.4μg的TRX-VL不能与各包被量的GST-NS1蛋白特异性结合,TRX-VH与GST-NS1蛋白的特异性结合可被1∶200稀释的GPV感染鹅血清完全阻断。

【目的】原核表达鸡细小病毒（ChPV）的NS1和VP2蛋白，制备其多克隆抗体，为深入探究ChPV蛋白结构功能及建立血清学诊断方法提供物质基础。【方法】通过合成ChPV GX-Ch-PV-21毒株的NS1和VP2蛋白基因序列，构建原核重组表达载体pET-32a-NS1和pET-32a-VP2，将测序正确的重组质粒转化至大肠杆菌transsetta感受态细胞进行原核表达，优化表达条件，以十二烷基硫酸钠—聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE）电泳和免疫印迹（Western-blotting）方法鉴定NS1和VP2蛋白的表达情况。将表达产物免疫无特定病原体（SPF）鸡获得多克隆抗体，采用酶联免疫吸附实验(ELISA)方法测定其效价，以Western-blotting和间接免疫荧光试验(IFA)对多克隆抗体进行鉴定。【结果】SDS-PAGE分析结果显示，NS1和VP2蛋白条带大小分别约为104.0和87.0 kD，与预期条带大小相符。对重组质粒pET-32a-VP2和pET-32a-NS1进行最佳诱导条件筛选，结果显示NS1蛋白表达的最佳诱导条件为异丙基-beta-D-硫代半乳糖吡喃糖苷（IPTG）终浓度1.0 mmol/mL，16 ℃诱导表达过夜；VP2蛋白表达的最佳诱导条件为IPTG终浓度0.8 mmol/mL，20 ℃诱导表达过夜。可溶性分析结果显示，NS1和VP2蛋白主要以包涵体形式存在；间接ELISA检测NS1和VP2蛋白的多克隆抗体效价均为1︰10240000；Western-blotting鉴定结果表明，His标签蛋白和相对应的鸡多克隆抗体均能与NS1和VP2蛋白特异性结合；IFA分析结果显示，VP2和NS1蛋白多克隆抗体均能与ChPV特异性结合。【结论】成功表达ChPV的NS1和VP2蛋白和制备的鸡多克隆抗体，可作为深入探究ChPV蛋白结构功能及建立ChPV血清学诊断方法的基础材料。

利用PCR方法扩增鲤疱疹病毒Ⅱ型(CyHV-2)ORF25基因的部分基因序列,并将扩增产物连接到原核表达载体pGEX-KG,成功构建了CyHV-2-ORF25-KG重组质粒。IPTG将其诱导后,SDS-PAGE分析表明:目的蛋白得到表达,分子质量大小为42ku,且主要以包涵体形式存在;用纯化的融合蛋白免疫BALB/c小鼠,多次免疫后通过细胞融合,筛选出1株单抗5C6;经间接免疫荧光试验和Western blot试验验证,这株单抗可以识别CyHV-2ORF25蛋白。

[目的]制备日本脑炎病毒prM蛋白的特异性单克隆抗体，对进一步了解prM的结构和功能、开发特异性检测方法以及JEV prM蛋白的功能研究奠定基础。[方法]将prM基因克隆至原核表达载体pET-32a，诱导表达并纯化prM重组蛋白，随后将其免疫小鼠，通过细胞融合和亚克隆得到分泌抗prM单克隆抗体的杂交瘤细胞株，制备腹水并进行效价测定，通过Western blot和IFA验证其特异性，并进行空斑中和试验测定其中和活性，利用原核表达多段截短体蛋白确定单克隆抗体抗原表位并进行保守性分析，将其初步应用于感染检测及亚细胞定位分析。[结果]经细胞融合和三次亚克隆后成功获得1株能稳定分泌抗prM单克隆抗体的细胞株，命名为4H6，所制备的腹水效价可达到1∶1638400，经鉴定该抗体重链属于IgG2b，轻链为κ型。Western blot以及IFA试验均证明该抗体具有良好的特异性。空斑减少中和试验显示4H6不具备中和活性。通过表达截短蛋白鉴定出4H6所识别的抗原表位位于³⁰GENRCWVRAIDVGYMC⁴⁵，结合生物信息学分析发现该表位位于prM蛋白表面且在JEV不同毒株之间高度保守，有利于抗原抗体的直接接触。并成功将4H6初步应用于JEV感染检测及prM蛋白亚细胞定位分析。[结论] 成功制备1种高效且特异性的JEV prM蛋白单克隆抗体，抗原表位识别区位于pr，为分析prM蛋白在病毒复制过程中的生物学功能以及与其他病毒蛋白（如E蛋白或宿主分子）之间的相互作用提供有效工具。

【目的】制备抗鸭坦布苏病毒（Ｄｕｃｋ Ｔｅｍｂｕｓｕ ｖｉｒｕｓ，ＤＴｍｕｖ）Ｎｓ５蛋白的单克隆抗体。【方法】将实验室保存的ＰｅＴ２８ａ－Ｎｓ５载体转化入ｒｏｓｅＴＴａ（Ｄｅ３）感受态细胞中进行诱导表达，利用纯化的鸭坦布苏病毒Ｎｓ５蛋白作为抗原免疫ｂａＬｂ／ｃ小鼠，应用淋巴瘤细胞杂交技术结合有限稀释法制备单抗，并对单抗的特异性、反应性及其抗原表位和亚类进行鉴定。【结果】筛选获得２株稳定分泌针对ＤＴｍｕｖ的Ｎｓ５蛋白单抗的杂交瘤细胞，分别命名为ａ４Ｄ１和ｂ４ｂ８。此２株杂交瘤细胞诱导ｂａＬｂ／ｃ小鼠的抗体效价均可达到１∶６４ ０００。间接ｅＬｉｓａ、ＷｅｓＴｅｒＮ ｂＬｏＴ和间接免疫荧光（ｉＦａ．．．

为研究L蛋白在乌鳢水泡病毒(snakehead vesiculovirus, SHVV)增殖过程中发挥的作用,扩增SHVV L基因的前900个碱基,将其克隆到载体pET-32a(+)中,构建原核表达质粒pET32a-L,并转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞。设置不同温度、IPTG浓度及诱导时间,选择最佳的表达条件。通过NI-NTA亲和层析柱纯化蛋白,并利用纯化的蛋白免疫新西兰大白兔,制备多克隆抗体。用Western blot鉴定抗体特异性,间接免疫荧光观察L蛋白在SHVV感染斑点叉尾鮰卵巢细胞(channel catfish ovary, CCO)中的定位情况。结果显示,纯化的L蛋白分子质量约42 ku,与预期大小相符。制备的L蛋白多克隆抗体可以与L蛋白发生特异性免疫反应,且L蛋白主要定位在细胞质,表明L蛋白多克隆抗体制备成功。

【目的】制备鸭瘟病毒（ＤＰＶ）ｇＢ蛋白单克隆抗体，为建立ＤＰＶ快速诊断方法及进一步鉴定ＤＰＶ的抗原表位奠定基础。【方法】克隆ＤＰＶｇＢ基因，构建其表达载体并进行原核表达，纯化ＤＰＶ ｇＢ蛋白，以其作为抗原免疫８周龄ＢＡＬＢ／ｃ小鼠，取其脾细胞与ＳＰ２／０骨髓瘤细胞进行融合，进行间接ＥＬＩＳＡ及亚克隆筛选，并对单抗亚类及抗原性进行鉴定。【结果】ＰｃＲ扩增出９１５ＢＰ的目的基因，成功连接于ＰＥＴ－２８Ａ载体，并转化大肠杆菌ＲｏＳＥＴＴＡ进行诱导表达，获得４株稳定分泌抗ＤＰＶ ｇＢ蛋白的杂交瘤细胞株，分别命名为Ａ８Ｄ７、Ｅ６ｃ３、Ｈ１１Ｆ８、Ｈ６Ｆ６，间接ＥＬＩＳＡ检测其腹水效价分别为１∶１０３、１．．．

锯缘青蟹呼肠孤病毒(Scylla serrata reovirus,SsRV)第9节段(S9)编码的p40蛋白可能为病毒的甲基转移酶(methyltransferase)。为了便于确认p40在病毒复制过程中扮演的角色,将S9片段的开放阅读框(ORF)克隆到原核表达载体pET28a(+),实现了在宿主表达菌E.coli BL21(DE3)中的高效表达,进而纯化了重组表达蛋白p40(rp40),并制备了抗SsRV p40蛋白的2株单克隆抗体(4B7、3E5)。经Western blot分析表明,2株单克隆抗体均可特异地识别rp40蛋白,以及识别SsRV病毒蛋白中分子量为46 ku和40 ku 2条...

采集某发病猪场病料进行疑似PRRSV分离鉴定,经克隆测序获得一株美洲型的高致病性PRRSV SD-TA株分离株,并对其N蛋白(核衣壳蛋白)基因设计引物进行克隆转化,构建重组质粒pET-30a-ORF7,鉴定后经诱导表达纯化获得大小约为21KD(含6×His标签蛋白)的重组N蛋白。将纯化蛋白免疫BALB/c小鼠,经间接ELISA检测后取脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行细胞融合,并对融合细胞上清进行抗体检测,通过有限稀释法,获得了2株能稳定分泌抗N蛋白抗体的杂交瘤细胞株,命名为6D10和3H5,经鉴定后两者均为IgG1型,且识别于不同的抗原位点,经Western-blot和IFA检测,单抗6D10...

为了筛选P1病毒VP1蛋白的特异性单抗,通过生物信息学软件预测其抗原表位,然后利用SEALTM方法制备针对不同抗原表位的单抗,再通过免疫组化试验和Western Blot对其中6株进行分析,筛选敏感性强、特异性好的单抗。结果显示,选取的6株单抗中有3株(mAb1、mAb6和mAb9)在免疫组化染色时呈阳性反应,有1株(mAb1)在Western Blot中表现强阳性。研究筛选出了P1 VP1蛋白的特异性单抗,为P1病毒的检测和疫苗研究奠定了基础。

根据鹅坦布苏病毒JS804株非结构蛋白NS1基因序列,设计1对特异性引物,利用PCR方法扩增得到完整的NS1基因,并将其克隆至原核表达载体pET28a和pET32a上,构建出重组表达质粒pET28a-NS1和pET32a-NS1,转化至BL21(DE3)中,经IPTG诱导得到NS1融合蛋白(His-NS1),其分子质量约分别为44,58 kDa,均在诱导后6 h达到表达量高峰。分析显示,2种融合蛋白均以包涵体形式存在,包涵体经过变性和复性后均可获得单一、高表达量的目的蛋白,为进一步开展关于鹅坦布苏病毒NS1蛋白的研究奠定了基础。

【目的】建立一种快速检测猪细小病毒(Porcine parvovirus,PPV)野毒抗体的方法。【方法】参照已发表的PPV基因组(AY502114.1)序列设计合成特异性引物,利用PCR扩增PPV NS1基因主要抗原区域,将目的片段定向克隆至表达载体pET30a(+),转化BL21(DE3)表达菌,用IPTG诱导表达重组蛋白。以该蛋白作为诊断抗原,经过对间接ELISA条件的优化,建立检测PPV抗体的NS1-ELISA诊断方法,对该方法的特异性、敏感性、重复性进行检测。用建立的PPV NS1-ELISA诊断方法和血凝抑制试验(HI)同时对临床送检的306份血清样品进行检测,比较二者的符合率。【...

【目的】制备非洲猪瘟病毒（African swine fever virus,ASFV）p30蛋白的单克隆抗体（monoclonal antibodies,MAbs）并初步分析其所识别的线性抗原表位，为ASFV及其抗体检测方法的建立及p30蛋白结构和功能的研究奠定基础。【方法】将原核表达并纯化的p30重组蛋白作为免疫原，免疫6—8周龄BALB/c雌鼠，每两周免疫1次，共免疫3次，首次免疫是抗原与等体积的弗氏完全佐剂乳化后免疫，第二次和第三次免疫与等体积的弗氏不完全佐剂乳化，3次免疫后1 w断尾采血，间接酶联免疫吸附试验（ELISA）检测血清抗体效价，选择血清效价最高的小鼠进行加强免疫，3 d后取小鼠脾淋巴细胞与SP2/0骨髓瘤细胞按照4:1的比例使用PEG进行常规细胞融合。利用重组p30蛋白作为包被抗原，间接ELISA筛选阳性杂交瘤细胞，有限稀释法进行克隆纯化，直至筛出能够稳定分泌抗体的MAbs。将ASFV接种于猪肺泡巨噬细胞，以筛选的MAbs为一抗、兔抗鼠HRP-IgG为二抗，进行间接免疫荧光试验（IFA）。将感染和未感染ASFV的细胞沉淀处理后进行SDS-PAGE并转印至硝酸纤维素膜，分别以IFA鉴定为阳性的MAbs上清为一抗、兔抗鼠HRP-IgG为二抗，进行Western blotting分析，筛选获得p30 MAbs。根据已知序列设计引物扩增p30ab与p30bc两段截短基因，其中p30ab代表由第86—153位氨基酸残基的截短体，p30bc代表由第120—187位氨基酸残基的截短体，原核表达部分重叠的截短p30蛋白，最终获得重组蛋白GST-p30ab与重组蛋白GST-p30bc。分别以GST-p30ab和GST-p30bc融合蛋白为包被抗原，以5株MAbs为一抗，以兔抗鼠HRP-IgG为二抗，通过间接ELISA方法初步定位p30蛋白的抗原表位。【结果】以纯化的重组蛋白为包被抗原，经间接ELISA试验筛选出25株可分泌抗重组p30蛋白的杂交瘤细胞株。IFA结果显示，5株MAbs(8F4、1D3、1H2、6C3和8E11)与ASFV感染的猪肺泡巨噬细胞IFA试验呈阳性；Western blotting结果显示，5株MAbs均能够与ASFV感染的细胞呈阳性反应，与未感染病毒的细胞呈阴性反应。试验构建的p30截短体重组蛋白GST-p30ab以可溶和包涵体两种形式表达，而GST-p30bc仅以包涵体形式表达，以两组截短体融合蛋白为包被抗原，通过间接ELISA检测出MAbs 8F4、1H2和6C3与两个重组蛋白均能有效结合，证明MAbs 8F4、1H2和6C3抗原识别区域为两组截短蛋白重叠区域，即第120—153位氨基酸；MAbs 8E11与1D3则只能与GST-p30ab蛋白结合，证明MAbs 8E11与1D3抗原识别区域为两个重组蛋白的非重叠区域，即第86—119位氨基酸。【结论】本研究可溶性地表达了p30蛋白的第86—153位氨基酸截短体重组蛋白，制备了5株p30 MAbs，定位到2个p30蛋白抗原表位。结合ELISA和IFA，可建立十分可靠的ASFV及其抗体的检测手段。

[目的]本研究旨在制备抗鹅星状病毒（goose astrovirus，GAstV）单克隆抗体，并鉴定其识别的抗原表位，为快速检测GAstV感染和研究P2蛋白的结构与功能奠定基础。[方法]通过原核表达系统表达并纯化GAstV-2 P2蛋白，将其做为免疫原免疫六周龄BALB/c雌鼠，利用杂交瘤技术，经过细胞筛选和亚克隆，获得3株能稳定分泌抗P2蛋白的单克隆抗体，利用Western Blot和间接免疫荧光（IFA）鉴定单抗特异性，用获得的单抗对阴阳性肾脏切片进行免疫组化检测，用间接ELISA测定单抗效价和亚型，同时构建P2蛋白的不同截短体来鉴定得到的单抗识别的抗原表位。[结果]本研究获得三株能稳定分泌抗P2蛋白抗体的杂交瘤细胞，命名为1B10、3C6、5B1。单抗效价分别为1:2048000、1:512000、1:256000，亚型鉴定结果显示，三株单抗的重链均为IgG2b，轻链均为Kappa型。Western Blot和IFA结果显示，三株单抗均可以特异性结合鹅星状病毒，免疫组化结果显示，5B1和3C6可以应用于免疫组化的检测。表位结果显示，1B10识别₁₀₉TSTTSTGGLITELRN₁₂₃，3C6识别₂₀₆LTDPEEDDDPLS₂₁₇，5B1识别₉₆LNPELETAVLRV₁₀₇。[结论]本研究成功制备识别不同抗原表位的三株单克隆抗体，为快速检测GAstV感染和研究P2蛋白的结构与功能奠定基础。