制备牛血清白蛋白-链霉素(SM-BSA)免疫Balb／c小鼠,用细胞融合技术制备抗链霉索单克隆抗体(SM mAb)杂交瘤细胞,体内诱生腹水法制备SM mAb。依据竞争ELISA原理,应用SM mAb研制SM快速ELISA检测试剂盒(SM-Kit),并对其灵敏度、准确度、特异性、基质效应性等进行检测。结果表明,SM-Kit标准曲线呈典型的S型,线性检测范围为1～128μg／L,相关系数R2=0．925 1,灵敏度为0．45μg／L,半数抑制浓度(IC50)为7．76μg／L,检测限为1μg／L;奶样、猪尿样的平均添加回收率分别为104．45％和84．1％;SM-Kit与双氢链霉素的交叉反应率(C...

【目的】制备高灵敏、高特异性的抗春雷霉素单克隆抗体,并对其免疫学特性进行鉴定。【方法】采用EDC法将KSM分别偶联于载体蛋白BSA和OVA上,分别合成免疫原KSM-BSA和包被原KSM-OVA,经SDS-PAGE鉴定后,免疫Balb/c小鼠,免疫间隔4周,4次免疫后,利用间接ELISA和间接竞争ELISA测定其多抗血清效价和敏感性,选出效价高、敏感性好的小鼠进行细胞融合,经过多次亚克隆筛选出分泌高敏感的特异性抗KSM单克隆抗体的杂交瘤细胞株,体内诱生腹水法制备抗KSM的单克隆抗体并对其免疫学特性进行鉴定。【结果】SDS-PAGE鉴定结果显示KSM-BSA成功偶联,间接ELISA检测显示免疫的6...

以BSA-CAP-HS免疫Balb／C小鼠,用细胞融合技术筛选抗氯霉素单克隆抗体(CAP mAb)杂交瘤细胞,体内诱生腹水法制备cAP mAb,并鉴定其免疫学特性;依据胶体金免疫层析试验(GICA)原理,以CAP mAb 为金标抗体,研制CAP残留快速检测金标试纸(CAP-Strip),并对其性能进行测定。结果表明,筛选出了3株杂交瘤细胞,其中最好的4F9-B2株间接ELISA效价细胞培养上清为1:1 280,腹水为1:640 000,亲和常数(Ku)为 1．84×1010 L/mol,对CAP的半数抑制浓度(IC50)为0．88μg/L,与氯霉素琥珀酸钠的交叉反应(CR%)为150%,与其他...

采用单克隆抗体制备技术,建立了分泌抗猪瘟病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株,液氮保存4年后复苏,细胞在HAT选择培养基中生长旺盛,分泌抗体稳定,分别命名为YNF1,YNF2,YNF3,YNF4,杂交瘤细胞染色体数介于96~115条。细胞培养上清和腹水的单抗间接ELISA效价分别为1∶80~1∶160和1∶5 000~1∶10 000。在间接ELISA和夹心ELISA检测中单抗与猪瘟病毒呈特异性反应,与正常的猪、兔肾组织提取液及其血清Ig无交叉。抗体蛋白属IgG类,亚类及轻链分别为IgG1/λ,IgG2a/κ,IgG2a/λ,IgG1/λ。结果表明,4株杂交瘤是分泌抗猪瘟病毒单克隆抗体的细胞株,可长期...

分泌ＩＨＮＶ－Ｂ病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立赵志壮，牛鲁祺（中国水产科学研究院黑龙江水产研究所，哈尔滨１５００７６）刘长明（中国农业科学院哈尔滨兽医研究所，１５０００１）关键词传染性造血器官坏死症病毒中国本溪株，单克隆抗体，杂交瘤ＥＳＴＡＢＬＩＳ...

在制备多克隆抗体的基础上,研制用于检测莠去津残留的间接竞争ELISA试剂盒。结果表明:莠去津抑制率回归曲线为y=19.762x+5.6026,相关系数R2=0.981,线性检测范围为1~5000μg·L-1,最低检测限为5.35μg·L-1,IC50为176.44μg·L-1。莠去津多克隆抗体的交叉反应率小于20%,莠去津试剂盒的添加回收率均高于75%,供试样品检测结果的批内和批间变异系数均低于10%。试剂盒在4℃或-20℃下贮存270d仍有效。

为了获得稳定、高效分泌抗软骨藻酸(DA)单克隆抗体的杂交瘤细胞株,采用活泼酯法制备软骨藻酸免疫抗原(DA-KLH)和包被抗原(DA-BSA),以DA-KLH免疫BALB/c小鼠,用细胞融合技术筛选抗软骨藻酸单克隆抗体杂交瘤细胞株,体内诱生腹水法制备大量单抗,捕获EL ISA法测定小鼠免疫球蛋白亚型,间接ELISA法测定腹水效价;用G蛋白亲和层析法来纯化腹水。结果显示,成功构建2株能稳定分泌DA单克隆抗体(McAb)的杂交瘤细胞株2B1和4C2,抗体亚类分别为IgG1和IgG2a,间接EL ISA检测小鼠腹水的抗体效价达1∶64 000,腹水纯化后蛋白浓度为1.27和0.675 mg/mL。研究...

【目的】利用蛋白质连接技术合成氟罗沙星(FLE)人工抗原,制备FLE高亲和力抗体,通过建立、优化FLE的icELISA检测方法研制出快速、灵敏的FLE残留检测间接竞争ELISA试剂盒。【方法】用DCC法偶联FLE和载体蛋白BSA合成免疫原FLE-BSA,用混合酸酐法偶联FLE和载体蛋白OVA合成包被原FIE-OVA,通过紫外扫描法(UV Scan)和聚丙烯凝胶电泳法(SDS-PAGE)鉴定人工合成抗原。选择经初步鉴定成功合成的FLE-BSA免疫SPF级6—7周龄Balb/c雌性小鼠5只,采用多点免疫法,对小鼠背部皮下4-6点注射免疫,免疫剂量为30μg/只,初免,用FLE-BSA PBS溶液与...

本研究旨在研制一种以紧密素为检测靶标的间接ＥＬＩＳＡ技术，检测血清中产志贺毒素大肠杆菌（ＳｈＩｇＡ ｔｏｘＩｇＥｎＩｃ ＥＳｃｈＥｒＩｃｈＩＡ ｃｏＬＩ，ＳｔＥｃ）的抗体水平。根据紧密素２７个亚型的ｎ端保守序列，体外表达３９０～５４３ ＡＡ片段制备包被抗原，通过敏感性、特异性、重复性和稳定性实验，建立检测ＳｔＥｃ的抗体的间接ＥＩＩＳＡ方法。经优化筛选的间接ＥＬＩＳＡ最佳反应条件：抗原包被浓度３ ｎｇ／孔，待检血清稀释比例１∶２００，ｈｒＰ－兔抗羊Ｉｇ ｇ、ｈｒＰ－兔抗牛Ｉｇ ｇ的工作浓度均为１∶１５０００，５％脱脂奶封闭Ｌ ｈ，底物作用时间１０ｍＩｎ，用于牛、羊疫苗抗体检测或者ＳｔＥｃ大肠杆菌．．．

【目的】建立诺氟沙星(norfloxacin,Nor)免疫检测试剂盒。【方法】基于所制备的诺氟沙星单克隆抗体,通过矩阵法筛选最佳抗体工作浓度和二抗工作浓度,建立诺氟沙星间接竞争ELISA试剂盒(Nor-kit),并对其性能进行了鉴定和确证。【结果】Nor-kit的平均IC50为5.18μg.L-1,灵敏度为0.31μg.L-1,检测限为1.00μg.L-1。试剂盒除了和诺氟沙星反应外,还和同系物中的培氟沙星、氧氟沙星、环丙沙星、洛美沙星及恶喹酸有不同程度的交叉反应。奶样中回收率平均为103.23%,变异系数(CV)为9.33%。3个不同批次试剂盒的测定结果中,批内变异系数小于10%,且批间变异...

以杂交瘤细胞为模型 ,在培养液中加入不同的信号转导抑制剂和囊素 ,用间接ELISA法测定抗体分泌水平 ,用定量RT PCR法检测抗体mRNA的表达水平。结果表明 ,加入Gα 蛋白选择性抑制剂NF 0 2 3、蛋白激酶C抑制剂GF10 92 0 3X、磷脂酰肌醇 3激酶抑制剂heparin、Ca2 + /calmodulin依赖蛋白激酶Ⅱ抑制剂KN 6 2、磷脂酶C抑制剂U 7312 2和蛋白激酶G抑制剂后 ,囊素对杂交瘤细胞抗体分泌速度的影响明显 (P

采用碳二亚胺(EDC)法合成卡那霉素完全抗原,免疫BALB/c小鼠,通过杂交瘤技术获得3株能稳定分泌抗卡那霉素单克隆抗体的杂交瘤(5D7、6H8、7G4)。选择其中的5D7株抗体,经ELISA鉴定,细胞上清的效价达103以上,腹水效价达到5×104以上;建立了间接竞争ELISA法,通过优化,其检测限为0.5ng/mL,抗体IC50为3.7ng/mL,与妥布霉素交叉反应率为63.8%,与其他抗生素无交叉。可见ELISA具有快速、敏感、特异、简便等特点,适合于KAN残留的快速检测,具有较高的推广应用价值。

【背景】副猪嗜血杆菌（Haemophilus parasuis,HPS）是猪的上呼吸道病原菌，引起格拉瑟氏病，主要引起断奶前后和保育阶段的猪发病，通常见于5—8周龄的青年猪，发病率一般为10%—15%。该菌有15种血清型，目前主要养猪国家流行的血清型为4型、5型、12型和13型，是严重危害养猪业发展的主要细菌性病原之一。目前国内还没有检测该菌抗体的商品化试剂盒。【目的】研制一种针对副猪嗜血杆菌的快速、敏感和特异性强的抗体检测试剂盒，为格拉瑟氏病的有效防控提供技术支持。【方法】表达并纯化OppA、DppA、HbpA 3种不同的副猪嗜血杆菌ABC转运体周质底物结合蛋白，使用副猪嗜血杆菌阴、阳性参考血清筛选以上3种蛋白中免疫反应性和反应特异性好的蛋白。以筛选的蛋白为包被抗原，建立检测HPS抗体的间接ELISA方法，优化间接ELISA反应条件，并组装试剂盒。在此基础上，确定该试剂盒的敏感性、特异性；通过对不同时间、不同猪场采集的2 000份临床猪血清样本进行检测，评价该试剂盒的实用性；在以上临床血清样本中随机选取200份，分别以研制的试剂盒、间接血凝试验以及进口商品化试剂盒进行检测，比较检测结果，验证该试剂盒的符合率；最后，使用研制的试剂盒检测免疫和攻毒猪采集的血清，评价该菌免疫后的抗体消长规律。【结果】成功表达并纯化了OppA、DppA、HbpA 3种蛋白，发现OppA免疫反应性和反应特异性最好。经过反应条件优化，确定OppA包被浓度为1μg·mL-1，封闭液为0.5%的BSA-PBS溶液，样品稀释液为1%的BSA-PBST溶液，样品孵育时间为30min，样品稀释度为1:50，酶标二抗孵育时间为3 0min，底物作用时间为15 min，临界值为0.18；试剂盒的敏感性和特异性为96.67%，能与国内常见血清型HPS阳性血清反应而不与猪其他常见病原阳性血清发生交叉反应；2 000份临床血清样本阳性检出率为34.65%；随机抽取200份血清样本，与间接血凝试验的符合率为92.50%，与进口商品化试剂盒符合率为87.00%，符合率较高；使用试剂盒检测免疫和攻毒后不同时间采集的猪血清，HPS抗体消长规律符合预期。【结论】研制的副猪嗜血杆菌ELISA抗体检测试剂盒特异性高、敏感性强，与商品化试剂盒和间接血凝试验的符合率高，可用于临床HPS抗体检测和疫苗免疫效果评价。

【目的】研制一种检测胞内劳森菌（Lawsonia intracellularis,LI）抗体的间接ELISA试剂盒，为LI的监测和疫苗评价提供工具。【方法】表达并纯化LI的外膜蛋白Omp2，以其为包被抗原建立检测LI抗体的间接ELISA方法，优化ELISA反应条件；用建立的ELISA方法检测稀释的LI阳性血清来评价试剂盒的敏感性，检测其他病原的阳性血清来评价试剂盒的特异性；试制3批试剂盒，制定试剂盒的敏感性和特异性检验标准，测定试剂盒在4℃的保存期；用试制的试剂盒检测LI阴性和阳性质控血清，研究试剂盒的成立条件；通过对不同时间和猪场采集的1 000份临床猪血清样本的检测来评价该试剂盒的实用性；用本试剂盒与进口商品化试剂盒平行检测LI阳性和阴性血清各50份以评价试剂盒的符合率。【结果】成功表达并纯化了Omp2蛋白，蛋白纯度为90.31%，在Western blot试验中可以与LI阳性血清发生反应。ELISA最佳反应条件为：Omp2以200 ng/孔4℃包被12-16 h；血清1﹕50稀释，37℃孵育30 min；羊抗猪Ig G-HRP 1﹕20 000稀释，37℃孵育30 min;TMB底物37℃显色15 min，用0.5 mol·L^-1的硫酸终止反应。该试剂盒检测LI阳性血清的最高检出倍数为8，敏感性较好；试剂盒检测E.coli、App、Mhp、SS2、PRRSV、PRV的结果均为阴性，特异性较好。制定了试剂盒的敏感性和特异性检验标准。试剂盒在4℃可保存15个月。试剂盒的成立条件为：阳性标准血清OD_450nm≥1.25，阴性标准血清OD_450nm<0.3。试制的试剂盒批内、批间重复性试验变异系数均小于10%。与国外商品化ELISA检测试剂盒对比的符合率达86%。用试制的ELISA试剂盒检测1 000份华东部分地区临床猪血清样品，其中LI阳性检出率为59.90%，表明LI在华东地区猪群中普遍存在。【结论】本研究开发的LI间接ELISA抗体检测试剂盒特异性高，灵敏度高，与商品试剂盒符合率高，可用于临床LI抗体的检测。

在建立磺胺甲噁唑单克隆抗体(SMZmAb)杂交瘤细胞株和阻断ELISA方法的基础上,研制出SMZ残留快速检测试剂盒(SMZ-Kit),并对其性能进行了测定。结果表明,SMZ-Kit的标准曲线呈典型的S型,符合4参数logit曲线拟合,相关系数R2=0.990 1,检测范围为1.0~128.0μg/L,灵敏度为0.73μg/L,半数抑制浓度(IC50)为11.5μg/L,检测限为1.0μg/L;饲料样、牛奶样的平均添加回收率为83.9%,83.3%,平均批内和批间变异系数均<15%;SMZ-Kit与磺胺嘧啶的交叉反应(CR%)为2.88%,与其他磺胺类药物无交叉反应;试剂盒在4℃可保存6个月。