【目的】研究抗禽流感病毒免疫的分子机制,发现新的抗禽流感病毒免疫相关基因,为抗禽流感转基因育种的研究奠定基础。【方法】随机选取40只30日龄AA白羽肉鸡,其中20只鸡注射禽流感H5亚型禽流感灭活疫苗,另20只未注射疫苗鸡作为对照,在注射后第9天取脾脏保存在液氮中。应用mRNA差异显示技术,结合反向northerndot blot鉴定技术,来筛选注射疫苗组和未注射疫苗组的差异表达基因。【结果】筛选出13条差异表达EST,其中未注射疫苗组4条,注射组9条表达量增高。应用BLAST工具将EST对核酸数据库nr和dbEST中所有序列进行了同源性分析。DD3、DD4、DD6、DD9、DD11、DD12与...

为了建立利用小麦生产禽流感口服疫苗的方法,选择禽流感病毒H5N1亚型表面抗原HA基因,与谷类作物启动子构建小麦表达载体,经基因枪法转入我国小麦栽培品种郑9023幼胚,在含5 mg/L草铵膦愈伤诱导培养基和分化培养基及含4 mg/L草铵膦生根培养基上筛选后,PCR鉴定获得转HA基因植株,Southern杂交分析转基因T1代植株证实,外源HA基因确已整合到小麦基因组中。

【目的】结合胶体金免疫层析技术建立一种适合养鸡业基层生产人员使用的便捷的快速诊断禽流感病毒感染鸡群的方法。【方法】将含禽流感病毒非结构基因ns1的表达载体KG-NS1转化入BL21(DE3)感受态细胞,筛选阳性克隆进行诱导表达,表达产物用GST亲和层析柱进行纯化和Western-blot分析;以NS1重组蛋白为诊断抗原,抗鸡IgFc的单抗标记的胶体金为示踪物,结合免疫层析技术,组装禽流感病毒NS1抗体的免疫胶体金鉴别诊断试纸条,评价其灵敏度和特异性,并对试验感染和临床采集的血样进行检测。【结果】NS1重组蛋白分子量约为52kD,具有免疫学活性。在25min内用肉眼观察到禽流感病毒感染鸡血清和N...

将H5N1亚型禽流感病毒血凝素(HA)基因构建到植物表达载体,经农杆菌法转入拟南芥基因组中,酶联免疫吸附(ELISA)测定分析T2代转基因株系,据OD值筛选获得HA基因高效表达株系;RT-PCR及Western blot分析进一步证实,这些转基因株系均可转录HA基因,翻译形成相应的蛋白质。拟南芥叶片中表达积累的HA蛋白经亲和层析纯化,Western blot分析检测到1条分子量为65 ku的蛋白质带,与预期的HA蛋白大小完全一致,没有发生蛋白质降解现象。表明禽流感病毒HA蛋白可在植物细胞中稳定表达,植物可用于生产禽流感疫苗。

[目的]本文旨在研究聚乙烯亚胺(PEI)配合灭活H5N1禽流感病毒口服免疫对鸡免疫反应和生长发育的影响。[方法]1日龄雏鸡35只,随机分成5组,每组7只。根据免疫方法分为口服生理盐水0.3 m L组(CK)、口服灭活禽流感病毒0.25 m L组(IAIV)、口服0.08 g聚乙烯亚胺配合0.25 m L灭活禽流感病毒组[IAIV+PEI(0.08)]、口服0.02 g聚乙烯亚胺配合0.25 m L灭活禽流感病毒组[IAIV+PEI(0.02)]和皮下注射灭活禽流感油乳佐剂疫苗组(i H)。分别在首次免疫后

【背景】H9亚型禽流感病毒(AIV)存在宿主范围扩大、毒力增强的趋势,并为其他亚型AIV重排提供基因,给养禽业和公共卫生造成极大威胁。水禽不仅是流感病毒的宿主,更是其天然储存库,在禽流感病毒的传播和变异中发挥着重要作用。因此有效控制水禽感染对养禽业健康发展、公共卫生安全具有重要意义。鸭肠炎病毒(DEV)属于疱疹病毒,能感染鸭、鹅等雁形目禽类,可引起产蛋下降及高死亡率。DEV基因组大,免疫原性好,具有开发成活疫苗载体的潜力。【目的】构建缺失gE基因、表达H9亚型AIV HA基因的重组病毒rDEV-△gE-HA,探讨重组病毒rDEV-△gE-HA作为防治DEV-AIV的二联重组活载体疫苗的可行性。【方法】以H9N2亚型禽流感病毒HA基因作为靶基因,构建含有HA基因表达盒的转移载体pT-gE-HA,将其与携带绿色荧光蛋白标记的重组rDEV-△gE-GFP共转染CEF细胞后,进行蚀斑筛选、纯化表达HA基因的重组病毒rDEV-△gE-HA;利用PCR、基因测序鉴定重组病毒;在CEF中连续传代重组病毒20次,测定外源基因传代稳定性。以10~3 TCID_(50)免疫易感鸭,分析重组病毒rDEV-ΔgE-HA对致死性DEV强毒攻毒保护效果;将不同剂量(10~3-10~6TCID_(50))rDEV-△gE-HA免疫鸭,免疫后14、21、28 d分别采集血清,测定H9血凝抑制(HI)抗体,并在免疫后28 d,以10~8EID_(50)的剂量静脉注射H9N2AIV(A/duck/GD/08),攻毒后2 d,采集喉拭子,进行病毒分离试验。【结果】将构建的转移质粒载体pT-gE-HA与rDEV-△gE-GFP共转染CEF细胞,经过3轮蚀斑筛选,获得纯化的重组病毒rDEV-△gE-HA。PCR鉴定及基因测序结果显示,HA基因成功地插入到DEV基因组中,替换了绿色荧光蛋白。重组病毒在CEF中至少能稳定传代20代。重组病毒rDEV-ΔgE-HA以10~3 TCID_(50)免疫易感鸭,能抵抗致死性DEV强毒攻击。重组病毒rDEV-Δg E-HA免疫易感鸭后14 d,各剂量免疫组均能检测到H9 HI抗体效价;免疫后21日,各组抗体效价水平略有上升,10~3TCID_(50)剂量免疫组HI抗体效价达到1:24,而10~4-10~6TCID_(50)剂量免疫组HI抗体效价在1:2~(2.4)-1:2~3。免疫鸭后28 d,用H9N2 AIV进行攻毒,10~3、10~4、10~6TCID_(50)免疫组均未从喉拭子分离到病毒H9N2,说明能完全保护,阻止喉头排毒,而10~5TCID_(50)免疫组保护率为80%(4/5),1/5病毒分离阳性。【结论】成功构建了稳定表达H9亚型AIV HA基因的重组DEV,该重组病毒保留了亲本毒的免疫原性,能抵抗致死性DEV强毒的攻击;免疫鸭后能诱导产生AIV HI抗体,尽管HI抗体滴度不高,但至少80%免疫鸭能阻止排毒。该研究为研制DEV-H9亚型AIV二联重组活载体疫苗奠定了基础。

流感病毒在野生鸟类中分布广泛,特别是野生水禽被认为是流感病毒的天然储库,因此,野生鸟类在禽流感传播过程中具有不容忽视的作用。在总结分析以往有关禽流感病毒的研究文献资料的基础上,对全球各亚型禽流感病毒在野生鸟类中的流行情况、流感病毒在野鸟中的分布特点、野鸭中的流感病毒、候鸟迁徙与流感病毒传播、野鸟禽流感病毒感染的季节性特征和自然环境介质在流感病毒传播中的作用等几个方面情况进行初步的探讨,旨在能够对禽流感病毒在野生鸟类中的生态分布情况、特点规律及其野生鸟类在禽流感传播和流行方面的作用有更深入的了解。

【目的】探讨自行研制的由贯众、板蓝根、黄芪、柴胡、连翘、黄连、金银花、黄芩及甘草配制的复方中药在体内、体外对禽流感病毒的抑制作用、药物代谢动力学、急性毒性试验及对SPF鸡免疫功能的影响。【方法】在鸡胚、MDCK细胞上进行复方中草药对H5N1和H9N2亚型禽流感病毒的直接灭活作用、治疗作用和预防作用;在体内通过药物累计法研究复方中药在昆明鼠体内的药物代谢动力学;采取口服和腹腔注射两种给药途径研究复方中药对昆明鼠的急性毒性试验;通过免疫器官的指数、在FAC上测量CD3+、CD4+、CD8+及TCR+的含量及采用血凝抑制(HI)方法检测血清中H9亚型禽流感抗体滴度研究复方中草药的对SPF鸡免疫功能的...

对主要用于我国高致病性禽流感防控的重组禽流感病毒H5亚型灭活疫苗的种类和使用情况,以及国内高致病禽流感流行株的主要分支情况作一介绍。随着病毒抗原性的不断变异,疫苗毒株也需随之进行更换,因此必须使用匹配相应分支的疫苗才能取得理想的防控效果。目前国内重组禽流感病毒H5亚型灭活疫苗的生产现状是共有10家生产企业,其中2个厂家采用悬浮细胞工艺生产,其余8个厂家均采用鸡胚工艺进行疫苗生产。笔者根据企业上报的产品批签发报告情况,以2016年至2017年农业部规定的高致病性禽流感强制免疫疫苗重组禽流感病毒H5亚型三价灭活疫苗(Re-6株+Re-7株+Re-8株)为例,着重从疫苗的安全性和效力两方面对4家重组禽流感灭活疫苗生产企业共计488批次产品的批签发检验数据进行了质量分析。从Re-6株、Re-7株、Re-8株不同组分效价的比较可以看出,所有批次疫苗抗体效价几何平均滴度(GMT)至少高于国家标准1个滴度以上,而Re-6株和Re-8株组分抗体效价(GMT)高于国家标准2个滴度以上。虽然产品的效价都超过了国家标准,但抗体水平还是参差不齐,较高产品的3个组分抗体效价(GMT)比较低的要高出1.5个滴度以上。各生产企业产品批间差异较大,这虽有生产工艺不断成熟和优化的因素,但对于相近批次产品批间差异出现较大差异,则说明企业生产工艺并不十分稳定。4个企业在2017年生产的疫苗各组分抗体效价GMT整体水平均比2016年有所提高,说明生产工艺的不断成熟和优化,企业对产品质量的进一步严格把关。我国禽流感病毒灭活疫苗含有的甲醛和细菌内毒素是造成疫苗副反应的直接原因,因此通过生产工艺改进,降低疫苗中甲醛和细菌内毒素的含量,可以降低疫苗的副反应。核酸疫苗是当前禽流感疫苗研究发展的前沿技术,是现阶段禽流感疫苗硏制中最具理想前景的疫苗,也是禽流感疫苗研究的一大热点。另外,具有交叉保护性的广谱免疫原性的通用疫苗可以有效的解决抗原漂移这一难题,是现阶段流感疫苗研究的一个重要研究方向。

为了解湖北鸡源禽流感病毒的遗传进化和氨基酸变异情况,将分离到的2株禽流感病毒进行全基因组测序及遗传进化分析。利用RT-PCR扩增流感病毒基因组片段,PCR扩增流感病毒片段、克隆至pMD18-T载体,并对序列特征进行生物信息学分析。结果表明:分离到的2株病毒高度同源,其HA和NA基因属于Y280谱系,PB1、PA、NP和NS基因属于SHF98-like谱系,PB2和M基因属于G1-like谱系;HA裂解位点均为-RSSR↓GLF-,具有低致病性流感病毒的分子特征;在HA蛋白上比当前流行株Y280多了一个潜在糖基化位点313(NCS);在234位点(对应H3编号中的226)产生了从Q到L的突变;在M2蛋白的31位点均产生了从S到N的突变。该2株H9N2亚型流感病毒为Y280谱系的病毒,这提示湖北地区可能也流行Y280-like分支禽流感病毒,虽然属于低致病性禽流感病毒(Low pathogenic AIV,LPAIV),但具有感染哺乳动物的潜在风险。

为调查我国多个省份鸡群中发生一种以眼睑肿胀出血、呼吸道症状、产蛋鸡产蛋率急性下降为特征的传染性疾病的致病病原，本研究对发病鸡群进行流行病学调查，病原分离鉴定，病毒全基因序列分析，并对分离病毒进行了动物回归试验。结果表明：1）该病自2021年12月首先发现于广东省某三黄鸡群，随后陆续在福建、安徽、江苏、河南等多个省份鸡群中发生，鸡群发病率高，后期易继发感染细菌，死亡率1%～10%;2）实验室初步诊断为H3N8亚型禽流感；3）全基因组序列分析表明，该病毒为新型禽流感病毒，系欧亚禽分支H3基因、北美禽分支N8基因与G57基因型H9N2病毒内部基因组成的三源重排病毒；4）新型H3N8病毒对SPF鸡高度易感，感染鸡表现为眼睑肿胀出血，轻微呼吸道症状；病理变化为哈德氏腺黏膜坏死，鼻甲、气管纤毛上皮细胞坏死，黏膜下层炎性细胞浸润，肺脏支气管肺炎；病毒可通过口咽和泄殖腔排毒，排毒时间为5～7d；病毒在鼻甲、气管和肺脏中可高效复制，并且可以在哈德氏腺等肺外脏器复制。综上，新型三源重排H3N8禽流感病毒对鸡高度适应，对呼吸系统致病性较强，应尽快开展系统的流行病学监测，及早对病毒的源头及传播途径进行防控，力争将这种新型病毒消灭在流行早期阶段。

【目的】验证斑鸠对H9N2亚型禽流感病毒的易感性,测定斑鸠呼吸道上皮细胞表面流感病毒受体的类型和分布。【方法】以5×104EID50/只的剂量经滴鼻、点眼途径感染A/Chicken/Beijing/2/2009(H9N2)亚型禽流感病毒,共感染8只斑鸠和8只SPF鸡,对试验斑鸠和SPF鸡进行临床症状、大体病变、组织学病变的观察及病毒抗原的定位、病毒分离和感染抗体的测定。【结果】攻毒后5d,斑鸠和SPF鸡未见异常临床表现和大体病变,病理组织学检查发现斑鸠的喉头、气管上段、中段和下段上皮细胞均有不同程度的脱落;在斑鸠的喉头、气管上段、中段和下段上皮细胞的胞浆内检测到了大量阳性流感病毒蛋白颗粒;斑鸠...

［目的］本文旨在了解Ｈ９Ｎ２亚型禽流感病毒神经氨酸酶（ＮＡ）基因的遗传特点和变异情况。［方法］选择２００８—２０１３年从江苏、安徽和浙江省家禽中分离的１１株Ｈ９Ｎ２亚型禽流感病毒，用ＲＴ－ＰＣＲ方法对ＮＡ基因片段进行扩增、克隆和序列测定，并对其核苷酸序列及推导的氨基酸序列进行同源性及遗传进化分析。［结果］１１株毒株的ＮＡ基因核苷酸和推导的氨基酸同源性分别为８６．２％～９９．５％和８６．９％～９９．１％，均属于欧亚分支。其中９株鸡源毒株属于Ｙ２８０－ｌｉｋｅ亚系，在ＮＡ蛋白颈部６３～６５位点缺失了３个氨基酸；２株鸭源毒株属于Ｇ１－ｌｉｋｅ亚系，在颈部３９～４０位点缺失了２个氨基酸。１１株分离株除．．．

参考GenBank上发表的H5亚型禽流感病毒(AIV)神经氨酸酶(NA)基因序列设计引物,PCR扩增NA基因,再将其克隆到原核表达载体pET-32a中,用E.coliBL21(DE3)原核表达,SDS-PAGE和Western-blot对表达蛋白进行鉴定。Western-blot结果表明,表达产物具有免疫学活性,蛋白的分子量约为61 kDa,位于包涵体中。包涵体经变性、复性处理,表达蛋白能与H5亚型AIV阳性血清发生特异性反应,具有良好的抗原性。ELISA检测结果表明,用此纯化蛋白作为包被抗原检测H5N1亚型AIV神经氨酸酶抗体具有良好的灵敏性。

【背景】流感病毒的抗原性主要是由病毒的表面糖蛋白HA决定的，前期利用欧亚类禽型H1N1猪流感病毒（EA H1N1 SIV）HA蛋白单克隆抗体（mAb）筛选抗原逃逸株发现，HA蛋白190、230和269位（H3编码）氨基酸的改变能够导致病毒发生抗原逃逸，并发现在新近分离的EA H1N1 SIV HA蛋白广泛存在这3个氨基酸的变异。【目的】进一步探索哪些氨基酸对病毒的抗原性具有关键作用，为流感的防控提供科学依据。【方法】选取一株病毒A/swine/Liaoning/SY72/2018(H1N1) SY72为模式病毒，建立该病毒的反向遗传系统（RGS），又以SY72为骨架，拯救含有HA基因190、230和269单点突变重组病毒；利用rSY72病毒制备灭活疫苗，分别免疫SPF鸡和非免疫猪制备其相应的血清，通过中和试验和血凝抑制（HI）试验分析病毒的抗原性，确定影响病毒抗原性的关键氨基酸位点；继而评估HA蛋白不同位点氨基酸的改变对病毒复制特性及受体结合特性等的影响。【结果】分析SY72病毒的HA氨基酸序列发现，该病毒HA蛋白分别含有190D、230M和269R。利用反向遗传技术，分别拯救了病毒rSY72及单点突变病毒rSY72HA/D190N、rSY72HA/M230I和rSY72HA/R269M；中和试验结果表明，与rSY72相比较，3株突变病毒均能够与两株mAbs发生一定反应；HI试验结果显示，与rSY72相比较，突变病毒rSY72HA/D190N与rSY72免疫鸡血清和猪血清的反应减弱，HI抗体效价分别出现了4倍和8倍的差异，而病毒rSY72HA/M230I和rSY72HA/R269M与两种血清的反应差异不明显，表明HA蛋白190位氨基酸改变对病毒的抗原性影响最为明显；病毒蚀斑测定及复制动力学研究结果发现D190N的氨基酸替换导致病毒rSY72HA/D190N在MDCK细胞上形成的蚀斑减小，而R269M的氨基酸替换导致病毒rSY72HA/R269M在MDCK细胞上的复制能力下降；3个位点的氨基酸替换均未影响病毒的受体结合特性。【结论】HA蛋白190位氨基酸对EA H1N1 SIV抗原性具有决定作用，269位氨基酸突变使得病毒在MDCK细胞上的复制能力降低。这提示在后续开展的病原学监测中要密切关注这些氨基酸的变异情况，提高对动物流感的预警预报。