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[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
马延森 李晓 陈志 兰向丽 武小椿 靳亚平 刘伟
【目的】制备抗果蝇组蛋白乙酰转移酶Atac2的单克隆抗体,为进一步研究Atac2基因的功能提供重要的试验工具。【方法】PCR扩增果蝇Atac2蛋白N端前26个氨基酸的编码基因,构建GST-Atac2融合蛋白表达载体pGEX-Atac2。转化大肠杆菌E.coli BL21(DE3),进行诱导表达,通过GST亲和层析法纯化GST-Atac2融合蛋白。以GST-Atac2为抗原免疫8周龄的Balb/c小鼠,取脾细胞,与SP2/0骨髓瘤细胞融合,间接ELISA法检测阳性孔,经有限稀释法亚克隆,筛选单克隆杂交瘤细胞株,检测抗体的特异性、效价和亚型,并检测其亲和常数。【结果】PCR扩增获得了目的片段。成功...
关键词：
果蝇 Atac2 原核表达 单克隆抗体
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
张鸯 陶明亮 路保通 靳亚平
【目的】制备抗Zhangfei蛋白的单克隆抗体,并鉴定其特性。【方法】用Zhangfei融合蛋白免疫Balb/c小鼠,取免疫小鼠脾细胞与SP2/0融合,筛选出阳性克隆,应用有限稀释法筛选抗Zhangfei蛋白的单克隆杂交瘤株;采用腹水诱生法制备单抗腹水,用饱和硫酸铵法纯化腹水抗体;采用间接ELISA、单克隆抗体亚型检测试剂盒、免疫印记技术、曲线拟合方案等分别鉴定单抗效价、亚型、特异性和亲和力等特性。【结果】免疫小鼠的血清抗体效价达1∶5 000以上,细胞融合克隆率为98.96%,阳性克隆率为30.18%,筛选出2株抗Zhangfei蛋白的单克隆杂交瘤细胞,其培养上清效价均达到1∶800,腹水单...
[期刊] 湖南农业大学学报(自然科学版)
[作者]
何靖玄 黄丽华 黄妤 张学文
线粒体琥珀酰辅酶A转移酶(SCOT)含有4个酪氨酸残基,其4、76位点酪氨酸(Tyr4、Tyr76)的硝基化可导致其酶活性下降,制备特定的抗体可对其硝基化水平和位点进行检测。应用淋巴细胞杂交瘤技术,以化学合成的含琥珀酰辅酶A转移酶硝基化Tyr4和Tyr76肽段为半抗原,偶联钥孔血蓝蛋白(KLH)后,作为免疫原免疫Balb/c小鼠,分离免疫鼠的脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,获得了多株融合细胞。经对融合细胞多次筛选和检测,最终获得4株单克隆抗体,分别对应SCOT Tyr4和Tyr76硝基化后表位,其间接ELISA检测效价分别达到1∶128 000、1∶32 000、1∶512 000和1∶4 ...
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
赵丹丹 刁有祥 杨国平 陈浩 提金凤 张璐
【目的】制备鸭瘟病毒（ＤＰＶ）ｇＢ蛋白单克隆抗体，为建立ＤＰＶ快速诊断方法及进一步鉴定ＤＰＶ的抗原表位奠定基础。【方法】克隆ＤＰＶｇＢ基因，构建其表达载体并进行原核表达，纯化ＤＰＶ ｇＢ蛋白，以其作为抗原免疫８周龄ＢＡＬＢ／ｃ小鼠，取其脾细胞与ＳＰ２／０骨髓瘤细胞进行融合，进行间接ＥＬＩＳＡ及亚克隆筛选，并对单抗亚类及抗原性进行鉴定。【结果】ＰｃＲ扩增出９１５ＢＰ的目的基因，成功连接于ＰＥＴ－２８Ａ载体，并转化大肠杆菌ＲｏＳＥＴＴＡ进行诱导表达，获得４株稳定分泌抗ＤＰＶ ｇＢ蛋白的杂交瘤细胞株，分别命名为Ａ８Ｄ７、Ｅ６ｃ３、Ｈ１１Ｆ８、Ｈ６Ｆ６，间接ＥＬＩＳＡ检测其腹水效价分别为１∶１０３、１．．．
关键词：
鸭瘟病毒 gB蛋白 单克隆抗体
[期刊] 水产学报
[作者]
王凡 林天龙 潘厚军 吴淑勤 杨金先 李巧苹
This paper described the preparation and characterization of monoclonal antibodies(Mab) against mandarin fish(Siniperca chuatsi) immunoglobulin(Ig),using the Mabs as a tool for analyzing the structure of S.chuatsi Ig,and monitoring the humoral immunity level of S.chuatsi.The purified serum Ig of S.c...
关键词：
鳜 免疫球蛋白 单克隆抗体
[期刊] 中国农业科学
[作者]
董飞 祭芳 吴季荣 殷宪超 徐剑宏 史建荣
【目的】克隆Tri101并通过原核表达获得纯化蛋白,通过免疫SPF大白兔获得高效价、高灵敏度的多克隆抗体,为Tri101蛋白及转Tri101作物的检测提供抗体基础【。方法】以禾谷镰刀菌(Fusarium graminearium)F3210为材料,PCR法获得Tri101并连接至表达载体pET29a(+),将重组表达载体转化大肠杆菌BL21(DE3)后利用IPTG进行诱导表达。利用纯化表达产物制备多克隆抗体。【结果】SDS-PAGE分析结果表明,Tri101在大肠杆菌BL21(DE3)中得到表达,重组蛋白大小为50 kD左右,以包涵体形式存在。利用HisTrap亲和柱纯化重组蛋白,最佳咪唑洗脱...
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
周云飞 朱春平 李燕 常婧竹 崔保安 李新生
【目的】制备H3N2亚型猪流感病毒(SIV)的单克隆抗体，为SIV的鉴别诊断奠定基础。【方法】将A/swine/Henan/1/2010(H3N2)猪流感病毒初步浓缩后，免疫6周龄的BALB/c小鼠，取小鼠脾细胞与瘤细胞NS0融合，采用间接ELISA方法筛选杂交瘤细胞，对杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体进行Western blot检验和抗原结合活性检测。【结果】经过3次有限稀释法克隆纯化，最终得到1株能稳定分泌单克隆抗体的阳性细胞株，命名为1C10，经检测其腹水抗体效价为1∶51 200。单克隆抗体亚型鉴定结果表明，1C10为IgG1亚型，轻链类型为κ链。Western blot检测结果表明，这株单...
关键词：
H3N2 猪流感病毒 单克隆抗体
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
杨国平 刁有祥 赵丹丹 陈浩 提金凤 张璐 张英 李川川
【目的】制备抗鸭坦布苏病毒（Ｄｕｃｋ Ｔｅｍｂｕｓｕ ｖｉｒｕｓ，ＤＴｍｕｖ）Ｎｓ５蛋白的单克隆抗体。【方法】将实验室保存的ＰｅＴ２８ａ－Ｎｓ５载体转化入ｒｏｓｅＴＴａ（Ｄｅ３）感受态细胞中进行诱导表达，利用纯化的鸭坦布苏病毒Ｎｓ５蛋白作为抗原免疫ｂａＬｂ／ｃ小鼠，应用淋巴瘤细胞杂交技术结合有限稀释法制备单抗，并对单抗的特异性、反应性及其抗原表位和亚类进行鉴定。【结果】筛选获得２株稳定分泌针对ＤＴｍｕｖ的Ｎｓ５蛋白单抗的杂交瘤细胞，分别命名为ａ４Ｄ１和ｂ４ｂ８。此２株杂交瘤细胞诱导ｂａＬｂ／ｃ小鼠的抗体效价均可达到１∶６４ ０００。间接ｅＬｉｓａ、ＷｅｓＴｅｒＮ ｂＬｏＴ和间接免疫荧光（ｉＦａ．．．
关键词：
鸭坦布苏病毒 NS5蛋白 单克隆抗体
[期刊] 水产学报
[作者]
周小愿 张星朗 贾秋红 韩亚慧 高宏伟
制备抗大鲵虹彩病毒（ＣＧＳＩＶ）ＭＣＰ ＣＯＥ蛋白的单克隆抗体，并对其基本特性进行鉴定及开展初步应用。用纯化的重组ＣＧＳＩＶ ＭＣＰ ＣＯＥ蛋白免疫ＢＡＬＢ／Ｃ小鼠，取免疫小鼠脾细胞与ＳＰ２／０骨髓瘤细胞融合，间接ＥＬＩＳＡ法检测阳性孔，经有限稀释法亚克隆，筛选单克隆杂交瘤细胞株。采用间接ＥＬＩＳＡ法、免疫印迹法和单克隆抗体亚型检测试剂盒等鉴定单抗的稳定性、特异性和亚型；采用腹水诱生法制备单抗腹水，饱和硫酸铵法纯化腹水单抗；间接ＥＬＩＳＡ法分别测定单抗杂交瘤细胞上清液和腹水单抗的效价；利用间接免疫荧光法观察ＣＧＳＩＶ的增殖。结果显示，细胞融合克隆率为９８．６８％，阳性率为２０．５２％，得到１株．．．
关键词：
大鲵 虹彩病毒 主要衣壳蛋白 单克隆抗体
[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
杨笑笑 杨兴淼 刘亚林 曹瑞兵
[目的]制备日本脑炎病毒prM蛋白的特异性单克隆抗体，对进一步了解prM的结构和功能、开发特异性检测方法以及JEV prM蛋白的功能研究奠定基础。[方法]将prM基因克隆至原核表达载体pET-32a，诱导表达并纯化prM重组蛋白，随后将其免疫小鼠，通过细胞融合和亚克隆得到分泌抗prM单克隆抗体的杂交瘤细胞株，制备腹水并进行效价测定，通过Western blot和IFA验证其特异性，并进行空斑中和试验测定其中和活性，利用原核表达多段截短体蛋白确定单克隆抗体抗原表位并进行保守性分析，将其初步应用于感染检测及亚细胞定位分析。[结果]经细胞融合和三次亚克隆后成功获得1株能稳定分泌抗prM单克隆抗体的细胞株，命名为4H6，所制备的腹水效价可达到1∶1638400，经鉴定该抗体重链属于IgG2b，轻链为κ型。Western blot以及IFA试验均证明该抗体具有良好的特异性。空斑减少中和试验显示4H6不具备中和活性。通过表达截短蛋白鉴定出4H6所识别的抗原表位位于30GENRCWVRAIDVGYMC45，结合生物信息学分析发现该表位位于prM蛋白表面且在JEV不同毒株之间高度保守，有利于抗原抗体的直接接触。并成功将4H6初步应用于JEV感染检测及prM蛋白亚细胞定位分析。[结论] 成功制备1种高效且特异性的JEV prM蛋白单克隆抗体，抗原表位识别区位于pr，为分析prM蛋白在病毒复制过程中的生物学功能以及与其他病毒蛋白（如E蛋白或宿主分子）之间的相互作用提供有效工具。
[期刊] 水产学报
[作者]
王梓璇 贾钊 邬恺正 朱晓真 王俊亚 冯浩 邹钧
为系统研究草鱼I型干扰素的合成、分泌和免疫功能，实验在大肠杆菌中表达并提纯了草鱼IFNa（CiIFNa）和IFNd（CiIFNd）重组蛋白。将CiIFNa和CiIFNd成熟肽分别克隆到pET-21d或pEHISTEVb表达载体上，并转化到大肠杆菌中；IPTG诱导表达获得CiIFNa和CiIFNd成熟肽的包涵体，经盐酸胍变性、蛋白复性和浓缩后，利用分子筛层析获得了纯度较高的重组蛋白。用重组蛋白免疫小鼠，通过PEG法诱导得到杂交瘤细胞；将稳定分泌抗体的阳性细胞株的细胞悬液注射入小鼠腹腔，制备腹水抗体并进行纯化。本研究纯化了草鱼CiIFNa和CiIFNd各2株抗体，并采用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）、酶联免疫吸附测定法（ELISA）、蛋白质印迹法（Western blot）和免疫荧光法对其进行了较全面的鉴定。研究结果表明，CiIFNa和CiIFNd单克隆抗体特异性好、效价高，能够特异识别在大肠杆菌和真核细胞中表达的重组蛋白，且不存在CiIFNa和CiIFNd分子间的交叉识别。本研究制备的单克隆抗体为深入研究草鱼干扰素的细胞来源和蛋白表达规律奠定基础。
[期刊] 华北农学报
[作者]
胡骁飞 魏凤仙 李青梅 职爱民 王方雨 孙亚宁 柴书军 付晓鹤
通过细胞融合建立分泌抗植酸酶单克隆抗体(mAb)的杂交瘤细胞株。采用体内诱生腹水法制备单克隆抗体,并对其免疫学特性进行鉴定。结果表明,筛选出2株杂交瘤细胞,其中,5C3细胞株产生单抗亚型为IgG1型,效价为1∶(1.02×106),IC50=100.07 ng/mL,亲和常数为6.70×109L/mol,与市售常规植酸酶、包被植酸酶及浓缩植酸酶的IC50分别达到130.43,126.16,125.33 ng/mL,交叉反应率分别为76.72%,79.32%和79.84%。与高温失活(100℃水煮5 min)的麸皮植酸酶、普通植酸酶、包被植酸酶及浓缩植酸酶IC50分别为4 205.45,4 01...
关键词：
植酸酶 杂交瘤 单克隆抗体 ELISA
[期刊] 华北农学报
[作者]
王凤芝 温立斌 姚火春 何孔旺
为了筛选P1病毒VP1蛋白的特异性单抗,通过生物信息学软件预测其抗原表位,然后利用SEALTM方法制备针对不同抗原表位的单抗,再通过免疫组化试验和Western Blot对其中6株进行分析,筛选敏感性强、特异性好的单抗。结果显示,选取的6株单抗中有3株(mAb1、mAb6和mAb9)在免疫组化染色时呈阳性反应,有1株(mAb1)在Western Blot中表现强阳性。研究筛选出了P1 VP1蛋白的特异性单抗,为P1病毒的检测和疫苗研究奠定了基础。
[期刊] 华北农学报
[作者]
谢志勤 谢芝勋 刘加波 庞耀珊 邓显文 谢丽基 范晴
用体外表达的蛋白作为免疫原来制备特异的单克隆抗体,并对制备的抗体进行鉴定。将ARVσ3蛋白基因在体外扩增,扩增产物与载体PGEX-4T-1连接并在基因工程菌中表达,体外表达的蛋白经纯化后作为免疫原来制备特异的单克隆抗体和ELISA检测包被抗原,测定纯化后蛋白的浓度,按每鼠100μg的蛋白用量免疫BALB/c小鼠,免疫4次后取其脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0按5∶1进行融合。对融合后的杂交瘤细胞及时筛选,阳性孔经3次有限稀释法克隆,通过间接E-LISA方法测定其抗体效价,并通过Western Blot、Dot-ELISA、直接免疫荧光、病毒中和等方法对获得的单抗特性进行检测。结果通过纯化的病毒含量...
[期刊] 水产学报
[作者]
林天龙 陈强 龚晖 刘晓东 俞伏松 杨金先 董传甫
应用杂交瘤单克隆抗体技术制备了 13个分泌抗欧洲鳗免疫球蛋白的单克隆抗体细胞株 ,并对这些单克隆抗体的特性进行了分析。经抗体级份和亚级份测定 ,其中IgM有 3株 ,IgG1有 5株 ,IgG2a有 3株 ,IgG2b有 2株 ;所有的单克隆抗体与欧鳗免疫球蛋白均有ELISA反应特性 ,抗体滴度 10 4～ 10 7,有七株单抗具有WESTERNBLOT反应特性 ,能在变性条件下识别欧鳗免疫球蛋白的重链。进一步实验证实这些单抗能特异地识别欧洲鳗、日本鳗的免疫球蛋白 ,而与鲫、淡水白鲳、罗非鱼、胡子鲶、美洲斑点叉尾血清免疫球蛋白以及水产动物常见病原菌如气单胞菌、爱德华氏菌、弧菌、柱状屈桡杆菌、...
关键词：
欧洲鳗鲡 单克隆抗体 免疫球蛋白
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