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[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
李晓晗 陈婧 周斌
[目的]线粒体作为重要的能量代谢细胞器，不仅可以调控宿主先天免疫通路影响病毒复制，而且其生物学功能的改变与病毒生命周期密不可分。本文旨在确定抑制日本乙型脑炎病毒（JEV）的线粒体靶向化合物。[方法]通过体外CCK-8、间接免疫荧光、蛋白免疫印迹及RT-qPCR等实验，对382种线粒体靶向化合物抗JEV的效果进行评价，筛选到的敏感药物在小鼠体内进行抗病毒效果验证。[结果] 体外实验证明，丙酮酸钠（Sodium 2-oxopropanoate）、布喹那（Brequinar）及松果菊苷（Echinacoside）三种线粒体靶向化合物对JEV复制有明显的抑制作用；动物实验结果表明，三种药物不仅有效抑制了JEV在小鼠体内的增殖，同时对小鼠的死亡率和体重变化也产生了明显影响，给药组小鼠体重增加明显高于对照组，且死亡率更低，其中以布喹那给药组最为明显。[结论]本研究成功筛选出3种抗JEV的线粒体靶向化合物，为探究线粒体在病毒复制中发挥的作用提供了借鉴，也为抗JEV的临床药物研发提供了新的思路。
[期刊] 浙江农林大学学报
[作者]
沈红霞 韩秀杰 赵凡凡 张保新 余风艳 王晓杜
猪Sus scrofa domestica日本乙型脑炎病毒(Japanese encephalitis virus,JEV)是引起母猪繁殖机能障碍的重要病原之一,其NS1蛋白参与病毒复制和组装、调节宿主免疫反应功能。提取猪日本乙型脑炎上海分离株的基因组RNA,反转录合成cDNA,扩增该病毒的NS1基因片段,亚克隆到原核表达载体pET-28(a)上,构建重组原核表达质粒pET-28(a)-JEV-NS1,转化大肠埃希菌Escherichia co1i BL21(DE3)菌株,IPTG诱导表达重组JEV-NS1蛋白,获得分子量大小为46 kDa的重组蛋白。为了提高表达量,JEV-NS1基因的958...
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
王韦华 张旭 张彦明 邢福珊 徐彦召
【目的】分离鉴定乙型脑炎病毒(JEV),确定分离毒株的基因分型及其E区段氨基酸的序列特征。【方法】采用BHK-21细胞培养法,从猪脑组织标本中分离出1株病毒,对其进行细胞和免疫荧光试验,同时采用RT-PCR扩增并克隆该毒株的PrM、E区段核苷酸序列,利用PrM(456~695位)区核苷酸序列与36株参考序列进行基因分型分析,并对E区核苷酸序列与减毒活疫苗株SA-14-14-2株的相应序列进行比对,分析分离株和疫苗株氨基酸的同源性及关键结构域的差异。【结果】分离出的病毒经细胞病变和直接免疫荧光试验证实为乙脑病毒,命名为SX-BJ07;用该病毒感染BHK-21细胞,72 h后所有细胞均发生病变(C...
[期刊] 福建农林大学学报(自然科学版)
[作者]
余风艳 韩秀杰 沈红霞 张保新 赵凡凡 王晓杜
提取猪日本乙型脑炎病毒(JEV)上海分离株的基因组RNA,反转录合成cDNA,扩增JEV-NS5基因片段,亚克隆到原核表达载体pET-28(a)上,构建重组原核表达质粒pET-28(a)-JEV-NS5,转化大肠埃希氏菌BL21(DE3)菌株,IPTG诱导表达重组JEV-NS5蛋白,获得分子质量为103 ku的重组蛋白.该蛋白主要以包涵体形式表达,表达量占总菌体蛋白的35%以上,His-band Ni+纯化后,获得高纯度重组蛋白占总蛋白的比例达75%以上.以纯化的蛋白免疫小鼠,制备小鼠抗JEV-NS5抗体,抗体效价达到3×104,并能与病毒感染的样本反应,证明该蛋白具有较好的特异性.
[期刊] 华北农学报
[作者]
赵珊 林华 陈世界 杨苗 薛昌华 郝中香 王彬 文彩芳 颜其贵
为了更有效地保护野猪资源，评估其作为种质资源的安全性及人类驯养的风险性，采用Ｔａｑ Ｍａｎ荧光定量ＰＣＲ监测野猪乙型脑炎病毒的携带情况。结果显示，Ｔａｑ Ｍａｎ荧光定量ＰＣＲ敏感性是常规ＰＣＲ检测方法的１００倍，检测时间缩短了１／２。重复性试验中，批内及批间变异系数均低于２％。对４０份家养野猪血液样品进行检测，Ｔａｑ Ｍａｎ荧光定量ＰＣＲ的阳性检出率为１０％，国标（ＧＢ／Ｔ ２２３３３－２００８）中ＲＴ－ＰＣＲ的阳性检出率为５％，灵敏度显著提高。表明该方法可用于野猪乙型脑炎的实时监测和流行病学调查，同时也为野猪群乙型脑炎的净化奠定基础。
[期刊] 华中农业大学学报
[作者]
刘学芹 曹胜波 李么明 孙敏轩 叶静 周锐 杨影 徐高原 陈焕春
以JEV的NS1基因mRNA为靶序列,设计合成了4个siRNA序列,构建了各自的表达质粒pS-NS1A、pS-NS1B、pS-NS1C和pS-NS1D。通过间接免疫荧光、Western blot检测、RT-PCR和病毒空斑检测等方法对这些siRNAs抑制JEV复制的效果进行了评价。结果表明4个siRNA表达质粒均对JEV在细胞中的复制具有不同程度的抑制作用,其中pS-NS1C、pS-NS1D有显著的抑制作用。说明针对NS1基因的siRNAs可以有效抑制JEV的复制,并有望成为应对JEV感染的治疗方法。
[期刊] 华北农学报
[作者]
赵珊 林华 陈世界 杨苗 薛昌华 郝中香 王彬 文彩芳 颜其贵
为了更有效地保护野猪资源,评估其作为种质资源的安全性及人类驯养的风险性,采用TaqMan荧光定量PCR监测野猪乙型脑炎病毒的携带情况。结果显示,TaqMan荧光定量PCR敏感性是常规PCR检测方法的100倍,检测时间缩短了1/2。重复性试验中,批内及批间变异系数均低于2%。对40份家养野猪血液样品进行检测,TaqMan荧光定量PCR的阳性检出率为10%,国标(GB/T223332008)中RTPCR的阳性检出率为5%,灵敏度显著提高。表明该方法可用于野猪乙型脑炎的实时监测和流行病学调查,同时也为野猪群乙型脑炎的净化奠定基础。
[期刊] 西南农业学报
[作者]
卢冰霞 李斌 秦毅斌 赵武 梁家幸 韦超文 何颖 苏乾莲 梁保忠 李莹莹 姜佳佳 杨盛斌 黄伟坚
对广西猪JEV FC792株的E基因主要抗原域Ⅰ、Ⅱ基因(Ea基因)进行原核表达及抗原性鉴定,为猪流行性乙型脑炎病毒(JEV)诊断抗原和基因工程疫苗的研制奠定基础。结果:成功构建广西猪JEV FC792株Ea基因的克隆重组质粒pMD18-T-Ea及表达重组质粒pET32a-Ea,经SDS-PAGE及Western blot鉴定表明,JEV FC792株Ea蛋白在Rosetta(DE3)菌中成功进行融合表达,表达出约58 KDa的融合蛋白;经抗原性鉴定表明,表达的融合蛋白Ea能与猪JEV阳性血清抗体发生特异性反应,融合蛋白Ea具有良好的JEV抗原性。
[期刊] 湖南农业大学学报(自然科学版)
[作者]
向卫军 杨涛涛 李润成 余兴龙
为探寻湖南汨罗地区猪场蚊子携带乙型脑炎病毒(JEV)的情况,对该地区3个猪场蚊子开展JEV的病原学调查研究。从该地区3个种猪场采集约3 900只蚊子,用RT–PCR方法扩增JEV NS5基因,结果从40份样品中检出17份样品呈阳性。将阳性样品研磨液接种BHK–21细胞分离病毒,经3次传代后获得了1株JEV,将新分离株命名为HNML1株。根据JEV的E基因序列设计1对引物,用RT–PCR方法扩增HNML1株的E基因,并进行序列测定和同源性分析,结果表明,该E基因的核苷酸序列与减毒活疫苗株SA14–14–2相
[期刊] 华北农学报
[作者]
禹乐乐 滕蔓 罗俊 迟佳琦 余祖华 柴书军 梁晓晓 张改平 王爱萍
为了解猪源乙型脑炎病毒(JEV)的全基因组结构及其分子进化规律,测定了3个JEV猪源分离株(BSF.ZZ-1、BSF.ZZ-3和CSF.XZ-2D)的全基因组序列,并对它们的氨基酸序列进行了分析。结果表明,CSF.XZ-2D全长为10 976 nt,而BSF.ZZ-1和BSF.ZZ-3全长均为10 977 nt,在后2个毒株基因组的10 701 nt位点处均有1个插入碱基"G"。BSF.ZZ-1、BSF.ZZ-3、CSF.XZ-2D与SA14株核苷酸和氨基酸同源性较高,核苷酸同源性都为99.4%,氨基酸同源性均为99.0%,与猪源分离株HW(HW1)、HWe(HW2)和SH0601的核苷酸与氨...
关键词：
猪 乙脑病毒 全基因组 系统进化分析
[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
张元鹏 杨占娜 杨利 李兰 于晓明 杜露平 陈瑾 侯立婷 乔绪稳 侯继波 郑其升
[目的]本试验旨在分析乙型脑炎病毒(JEV)感染猪睾丸(ST)细胞和正常ST细胞miRNA差异表达谱,以探索miRNA在JEV感染过程中的作用及其调控机制。[方法]分别提取正常ST细胞和JEV感染8 h后的ST细胞总RNA,利用高通量测序技术检测分析ST细胞中的miRNA表达谱并进行差异分析。使用miRanda软件对表达差异显著miRNA的靶基因进行预测并对靶基因进行GO分析。选取6个显著性差异表达的miRNA通过RT-qPCR进行验证。[结果]与正常ST细胞相比,JEV感染后的ST细胞有112个差异表达miRNA,其中80个miRNA上调表达,32个miRNA下调表达。经RT-qPCR方法验证6个差异表达的miRNA结果与高通量测序结果一致。差异表达miRNA靶基因的生物学功能相对集中在细胞代谢、细胞黏附等生物过程。[结论]检测和分析JEV感染后猪睾丸细胞的miRNA表达谱,获得了大量的与JEV感染相关的miRNA表达谱数据,为揭示JEV感染生殖系统致病机制提供了有效的数据和理论基础。
[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
杨笑笑 杨兴淼 刘亚林 曹瑞兵
[目的]制备日本脑炎病毒prM蛋白的特异性单克隆抗体，对进一步了解prM的结构和功能、开发特异性检测方法以及JEV prM蛋白的功能研究奠定基础。[方法]将prM基因克隆至原核表达载体pET-32a，诱导表达并纯化prM重组蛋白，随后将其免疫小鼠，通过细胞融合和亚克隆得到分泌抗prM单克隆抗体的杂交瘤细胞株，制备腹水并进行效价测定，通过Western blot和IFA验证其特异性，并进行空斑中和试验测定其中和活性，利用原核表达多段截短体蛋白确定单克隆抗体抗原表位并进行保守性分析，将其初步应用于感染检测及亚细胞定位分析。[结果]经细胞融合和三次亚克隆后成功获得1株能稳定分泌抗prM单克隆抗体的细胞株，命名为4H6，所制备的腹水效价可达到1∶1638400，经鉴定该抗体重链属于IgG2b，轻链为κ型。Western blot以及IFA试验均证明该抗体具有良好的特异性。空斑减少中和试验显示4H6不具备中和活性。通过表达截短蛋白鉴定出4H6所识别的抗原表位位于30GENRCWVRAIDVGYMC45，结合生物信息学分析发现该表位位于prM蛋白表面且在JEV不同毒株之间高度保守，有利于抗原抗体的直接接触。并成功将4H6初步应用于JEV感染检测及prM蛋白亚细胞定位分析。[结论] 成功制备1种高效且特异性的JEV prM蛋白单克隆抗体，抗原表位识别区位于pr，为分析prM蛋白在病毒复制过程中的生物学功能以及与其他病毒蛋白（如E蛋白或宿主分子）之间的相互作用提供有效工具。
[期刊] 华中农业大学学报
[作者]
刘辉 熊金凤 邹浩勇 陈杨 杨维红 何启盖
根据猪瘟病毒(CSFV)的E2基因保守序列、猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒(PRRSV)的ORF7基因及部分ORF6和3-UTR基因序列和猪乙型脑炎病毒(JEV)的E基因保守序列,设计了3对引物,扩增大小分别为288 bp4、30 bp和1 015 bp目的片段。以纯培养病毒抽提RNA,制备cDNA模板,利用3对引物,通过条件的优化,建立了同时检测这3种病毒的多重RT-PCR。CSFV、PRRSV和JEV的RNA最小检出量分别为0.270 ng、0.049 ng、0.067 ng,其它的RNA病毒如TGEV以及DNA病毒如PPV、PrV、PCV-2检测结果为阴性。以-βactin为对照,利用本方法...
[期刊] 西南农业学报
[作者]
叶茂 郭万柱 徐志文 王小玉 李云云
为了构建和筛选良好的猪乙型脑炎和猪细小病毒的核酸疫苗,并提高核酸疫苗的免疫效果,用重叠PCR法把PPV VP2和JEV E10连接,再将扩增的IFN-γ连入构建载体pcDNA.VEI使其共同表达。用脂质体将pcDNA.VEI介导入Vero细胞,通过间接免疫荧光法检测目的基因的体外表达。用pcDNA.VEI和不表达IFN-Κ的pcDNAZ.VE分别免疫Balb/c小鼠,同时设立PBS、猪细小病毒灭活疫苗、乙型脑炎弱毒疫苗和pcDNA3.1空白质粒免疫对照组。共免疫两次,间隔2周检测免疫指标。结果表明,通过鉴定核酸疫苗的构建达到了预期目标,并可在荧光显微镜下观察到了其转染的Vero细胞。该核酸疫苗...
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
冶贵生 张彦明 徐浩 郭抗抗
利用RNA干扰在线生物学软件分析猪瘟病毒NS3基因,设计针对NS3基因不同位置的小发卡RNA(short hairpin RNA,shRNA)干扰序列(其结构特征为正链(19nt)-环(9nt)-负链(19nt))。化学合成这些序列,并退火连接为双链干扰片段,将双链干扰片段定向克隆到干扰载体中,构建重组载体pGene-NS3-1,pGene-NS3-2和pGene-NS3-3,转化DH5α大肠杆菌感受态细胞,对转化产物进行kan+筛选,碱裂解法提取重组质粒,将酶切鉴定为阳性的质粒测序。结果显示,双链干扰片段克隆方向正确,序列中未出现核苷酸的插入,缺失等突变现象。表明靶向猪瘟病毒NS3基因shR...
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