采用生物信息学方法对已在GenBank上注册的木薯、木油桐、蓖麻、麻风树、油桐和天山雪莲的△9硬脂酰-ACP脱饱和酶(Stearoyl-ACP desaturase,SAD)核酸序列以及推导的氨基酸序列、组成成分、导肽、跨膜拓扑结构、疏水性、亲水性、蛋白质二级结构与功能域及三维结构进行分析预测和推断.结果表明:木薯、木油桐、蓖麻、麻风树、油桐和天山雪莲的SAD核酸序列以及推导的氨基酸序列、组成成分均比较一致;木薯SAD存在叶绿体转运肽,天山雪莲SAD存在线粒体目标肽,均无跨膜结构;α-螺旋和无规卷曲是该蛋白质二级结构的主要结构元件,β-转角和延伸链散布于整个蛋白质中,只有一个功能结构域位于第6...

硬脂酰－酰基载体蛋白脱饱和酶是植物脂肪酸合成代谢的关键酶，直接调节膜脂和贮脂中饱和脂肪酸和不饱和脂肪酸的比例。本研究通过ＲＴ－ＰＣＲ及ＲＡＣＥ技术，克隆乌桕硬脂酰－酰基载体蛋白脱饱和酶（ＳＳＳＡＤ）的ＣＤＮＡ全长序列。结果显示，该序列包含１个１１９１ ｂＰ的完整的开放阅读框（ＧＥＮｂＡＮｋ登录号为ＥＦ０７９６５５），编码３９６个氨基酸，含３３个氨基酸的叶绿体转移肽。其成熟肽含有３６３个氨基酸，推测其分子量为４１．５ ｋＤＡ，等电点为５．４２。同源性分析及同源建模数据显示ＳＳＳＡＤ和其它物种的ＳＡＤ有较高的同源性，含有１个保守结构域。构建原核表达载体ＰＭＡＬ－ＳＳＳＡＤ，转入大肠杆菌ＤＨ５α，并．．．

【目的】对芝麻△9硬脂酰-ACP脱饱和酶基因SiSAD(△9 stearoyl acyl-carrier-protein desaturase)进行克隆与表达分析,并转入拟南芥,探究其在油酸合成过程中的作用,为芝麻油酸含量的遗传改良提供分子基础。【方法】提取中芝13叶片的总RNA,反转录为cDNA。根据芝麻基因组数据库中的SiSAD序列信息(序列号为SIN_1008977)设计引物,以cDNA为模板,通过RT-PCR克隆获得SiSAD编码区序列,并与参考基因组序列进行比较。利用InterPro进行保守结构域分析,获得SiSAD蛋白的保守结构域。利用BLAST对SiSAD蛋白进行同源对比,获得SiSAD的同源蛋白质。采用邻接法构建系统进化树,获得芝麻SAD蛋白与橄榄、牵牛花、蓖麻、莴苣、葡萄、柑橘、拟南芥等植物SAD蛋白的亲缘关系。通过荧光定量PCR检测SiSAD在2个芝麻品种中芝33和中丰芝一号的根、茎、叶、蕾和种子中的相对表达量,分析SiSAD的表达特异性。将SiSAD连接过表达载体,通过农杆菌介导法转化野生型拟南芥(Col-0),筛选阳性后代,对T3代转基因和野生型的拟南芥种子中硬脂酸和油酸相对含量进行测定,分析SiSAD的功能。【结果】成功获得SiSAD的编码区序列,与参考基因组序列一致,全长为1 152 bp,编码383个氨基酸,SiSAD蛋白的分子量为43 kD,等电点为6.18。发现SiSAD蛋白含有一个保守结构域,属于脂肪酸去饱和酶家族成员,与其他植物的SAD蛋白质序列的同源性较高,暗示SiSAD在不同物种中的功能可能比较保守。系统进化分析显示,芝麻SAD蛋白与牵牛花和橄榄的SAD蛋白处于同一分支,进化关系较近,与蓖麻、拟南芥、柑橘的SAD蛋白亲缘关系较远。荧光定量PCR结果表明,SiSAD在芝麻种子中的表达量远远高于其他组织,有显著的组织特异性。成功构建了SiSAD的过表达载体,通过农杆菌介导法转化拟南芥,结果表明SiSAD成功导入拟南芥中,而且转录水平很高。对T3代转基因拟南芥种子中硬脂酸和油酸的相对含量分析表明,与野生型拟南芥比较,3个转SiSAD拟南芥株系中硬脂酸(C18:0)含量分别降低了3.0%、4.8%和6.1%,而油酸(C18:1)含量分别升高了2.8%、4.3%和7.8%,平均升高4.97%。【结论】克隆获得芝麻SiSAD的全长cDNA序列,鉴定了SiSAD的功能,发现SiSAD在油酸合成代谢过程中正向增加油酸含量,可应用于高油酸芝麻新品种培育。

根据NCBI中大豆fad2-1序列设计引物,用PCR方法从大豆的基因组DNA中扩增大豆脂肪酸脱饱和酶基因,克隆到pMD18-Tvector中,转化大肠杆菌JM109菌株,进行测序与比对。然后,将其反向克隆到表达载体pBt,转化农杆菌菌株LBA4404,经双酶切鉴定和PCR扩增检测,获得具有该基因的农杆菌工程菌。结果表明,克隆的fad2-1基因为1 196 bp,基因序列与NCBI中已发表的fad2-1序列只有4%的差异,相似性大于95%,说明克隆的基因是大豆fad2-1基因;构建了该基因的反向表达载体,转入农杆菌内。这为利用农杆菌介导法把该反义基因转入大豆,改良脂肪酸成分奠定了基础。

桐油是制备生物柴油的优势原料。delta 8脱饱和酶基因与植物膜脂、鞘磷脂的生物合成及细胞信号传递途径有关。通过简并PCR扩增、3’RACE、5’RACE及编码区扩增获得了油桐delta 8脱饱和酶的全长c DNA序列。该基因全长1 787 bp,ORF的长度为1 344 bp,编码447个氨基酸。经过网上比对分析,发现油桐delta 8脱饱和酶与其它植物的此基因具有较高同源性,其中与蓖麻脂肪酸去饱和酶相似度达83%。研究结果为揭示油桐油脂合成途径及分子定向育种奠定基础。

桐油是制备生物柴油的优势原料。ｄｅｌｔａ ８脱饱和酶基因与植物膜脂、鞘磷脂的生物合成及细胞信号传递途径有关。通过简并ＰＣＲ扩增、３’ＲａＣｅ、５’ＲａＣｅ及编码区扩增获得了油桐ｄｅｌｔａ ８脱饱和酶的全长Ｃ ｄＮａ序列。该基因全长１ ７８７ ｂＰ，ＯＲＦ的长度为１ ３４４ ｂＰ，编码４４７个氨基酸。经过网上比对分析，发现油桐ｄｅｌｔａ ８脱饱和酶与其它植物的此基因具有较高同源性，其中与蓖麻脂肪酸去饱和酶相似度达８３％。研究结果为揭示油桐油脂合成途径及分子定向育种奠定基础。

硬脂酰辅酶A去饱和酶(stearoyl-CoA desaturates, SCD)是单不饱和脂肪酸合成的关键限速酶,它在调节肝脏脂肪生成、脂肪酸代谢和脂质氧化方面发挥着重要作用。在本研究中,利用RACE技术克隆了吉富罗非鱼(Oreochromisniloticus)的完整scdcDNA序列,qRT-PCR分析了组织表达特点。为了验证scd基因的功能,利用CRISPR/Cas9技术构建scd基因敲除斑马鱼模型,研究了F3突变体的表型和基因表达变化,并结合高脂饲料实验验证了scd基因缺失后斑马鱼脂代谢的调控机制。结果显示,吉富罗非鱼scdcDNA序列全长1333bp,其中包括173 bp、1008 bp、152 bp的5'非编码区、开放阅读框和3′非编码区,编码335个氨基酸。scd基因在雄性和雌性罗非鱼的各组织中都有表达,在肝脏内表达量最高,脾脏内表达量最低。利用CRISPR/Cas9构建了scd基因敲除的斑马鱼(Daniorerio)模型进行功能验证,与野生型[SCD(+/+)]斑马鱼相比,纯合型[SCD~((–/–))]斑马鱼腹部明显膨大。Western blot和qRT-PCR结果显示,与SCD(+/+)组斑马鱼相比, scd基因在SCD~((–/–))组斑马鱼中表达显著降低(P

为了研究鳜(Siniperca chuatsi)脂蛋白脂酶(LPL)、肝脂酶(HL)基因结构与功能关系,首先采用RT-PCR及RACE法,克隆得到鳜肝脏LPL与HL基因cDNA全序列。鳜肝脏LPL基因cDNA全长为2089bp,其中开放阅读框(ORF)为1548bp,编码515个氨基酸。鳜HL基因cDNA全长为1964bp,其中ORF为1494bp,编码497个氨基酸。进化树分析显示,鳜LPL与HL基因与其他脊椎动物的LPL、HL基因各自聚集成簇。对鳜基因组进行PCR获得鳜LPL与HL全基因组DNA序列,与其他脊椎动物基因结构相似,鳜LPL基因由10个外显子和9个内含子组成,全长7392bp;...

利用蛋白酶的溶蛋白特性 ,结合琼脂免疫扩散试验 ,建立了脱脂奶溶蛋白琼脂扩散抑制试验的新方法 ,用以检测兔血清中的嗜水气单胞菌 (Aeromonashydrophilla)胞外蛋白酶抗体。同时与琼脂扩散免疫沉淀试验及ELISA试验进行了比较 ,结果显示 ,该方法的敏感性优于琼脂扩散免疫沉淀试验 ,而与ELISA试验相当

利用生物信息学的方法对DMRT1基因推导的氨基酸序列进行结构特征和功能域预测分析,探讨了DMRT1的信号肽、亲/疏水性、跨膜拓扑结构、卷曲螺旋结构、基序、功能域及高级结构。结果表明:DMRT1基因推导蛋白不含螺旋卷曲区域,没有信号肽,是一个非跨膜的亲水性稳定蛋白,该蛋白以游离形式存在于细胞质内,不会发生跨膜运动。DMRT1基因推导蛋白包含两个相同的保守的功能结构域,分别行使性别调控,使DNA形成二聚体和结合回纹结构的功能。DMRT1基因推导蛋白含有多个磷酸化位点,推测它可能在细胞信号传导中发挥作用,且其生物活性可能接受信号途径中多种信号的调控。DMRT1的高级结构中含有两个α-螺旋区域。以上结...

采用分子克隆技术克隆了黄羽肉鸡胰蛋白酶原（ＴＲＹ）基因，并运用多种生物信息学软件对ＴＲＹ蛋白质结构和功能进行了分析和预测，研究ＴＲＹ在禽类消化过程中的作用．结果表明：黄羽肉鸡ＴＲＹ基因的开放阅读框全长７４７ ｂｐ，由２４８个氨基酸残基组成，其中包含１５个氨基酸的信号肽（ＭＫＦＬＶＬＶＡＦＬＧＶＡＶＡ）和１０个氨基酸的激活肽（ＦｐＩＳＤＥＤＤＤＫ）；该蛋白分子质量为２６．１ Ｋｕ，含有信号肽，不含有糖基化位点，有１１个磷酸化位点；此外，该蛋白属于疏水性蛋白，但不存在跨膜区．氨基酸序列比对的结果表明：黄羽肉鸡ＴＲＹ具有丝氨酸蛋白酶的保守结构特征，如含有催化三联体氨基酸（组氨酸－６４、天冬氨酸－１１．．．

缺刻缘绿藻（Myrmecia incisa Reisigl）是一种富含多不饱和脂肪酸的球形单细胞淡水绿藻。在脂肪酸合成途径中，脂肪酸去饱和酶与脂肪酸酰基结合载体结合进行脂肪酸去饱和反应。为探究与缺刻缘绿藻中Δ15脂肪酸去饱和酶（fatty acid desaturase，FAD）结合的脂肪酸酰基结合载体，选用酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）INVSc1和聚球藻（Synechococcus sp.）PCC7942分别验证Δ15 FAD与酰基辅酶A（酰基-CoA）或酰基载体蛋白（酰基-ACP）结合的脂肪酸去饱和过程。根据缺刻缘绿藻的Δ15 FAD基因构建双源表达载体pYES2-Δ15 FAD和pCAMBIA1300-Δ15 FAD，通过电穿孔法将重组表达质粒分别转入酿酒酵母INVSc1和聚球藻PCC7942中，筛选得到转基因菌株。取相同细胞数的转基因酵母和转基因聚球藻，培养时分别添加等量的底物亚油酸（linoleic acid，18:2~(Δ9，12)，LA），以LA作为酰基受体，使其进入转基因酵母和转基因聚球藻的生物合成途径中，培养36～72 h。利用气相色谱-质谱联用系统对总脂肪酸的各组分进行分析，结果显示，在转基因实验组中检测到LA和α-亚麻酸（α-linolenic acid，18:3~(Δ9，12，15)，ALA）的存在，空白实验则未检测出相应的产物。通过计算，转基因酵母催化LA生成ALA的效率29.31%，转基因聚球藻催化底物LA生成ALA的效率为30.86%。根据结果证明无论是酰基-ACP还是酰基-CoA，与缺刻缘绿藻中的Δ15 FAD结合进行反应的效率相近，不存在偏好性，由于Δ15 FAD是特异性蛋白，因此证明缺刻缘绿藻中的Δ15 FAD属于脂酰基结合蛋白。

以大豆分离蛋白为原料提取7S球蛋白,研究了风味复合蛋白酶对大豆7S球蛋白的改性作用,并且评价了7S球蛋白改性前后的功能性质。结果表明,试验得到的7S球蛋白的持水性、乳化能力和吸油性优于大豆分离蛋白。风味复合蛋白酶酶解最佳的条件为pH值8.5,温度55℃。7S球蛋白改性后功能性质优于改性前。改性后7S球蛋白持水性有明显改善,在水解度为18.43%效果最好。吸油性、乳化性及乳化稳定性也有明显改善,在16.07%的水解度时效果最好。

为研究磷脂酰丝氨酸(PS)对凡纳滨对虾血蓝蛋白合成、酚氧化酶活性的影响,并探讨PS激活凡纳滨对虾血蓝蛋白发挥酚氧化酶活性的机制,实验采用5、10和20μg/mL 3个PS浓度对凡纳滨对虾尾节肌肉进行注射,注射量为50μL,对照组注射生理盐水,各处理组设3个平行组,取样时间为0、6、12、24、36、48和60 h,分别测定了血浆血蓝蛋白含量,肝胰脏血蓝蛋白p75、p77亚基和mRNA的表达以及血浆血蓝蛋白酚氧化酶活性。结果显示:与对照组相比,血蓝蛋白含量在6 h内略有下降,6～36 h内呈峰值变化,24 h时达到最大值(P

【目的】制备抗果蝇组蛋白乙酰转移酶Atac2的单克隆抗体,为进一步研究Atac2基因的功能提供重要的试验工具。【方法】PCR扩增果蝇Atac2蛋白N端前26个氨基酸的编码基因,构建GST-Atac2融合蛋白表达载体pGEX-Atac2。转化大肠杆菌E.coli BL21(DE3),进行诱导表达,通过GST亲和层析法纯化GST-Atac2融合蛋白。以GST-Atac2为抗原免疫8周龄的Balb/c小鼠,取脾细胞,与SP2/0骨髓瘤细胞融合,间接ELISA法检测阳性孔,经有限稀释法亚克隆,筛选单克隆杂交瘤细胞株,检测抗体的特异性、效价和亚型,并检测其亲和常数。【结果】PCR扩增获得了目的片段。成功...