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[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
李培培 张皛 潘小玫 王金生 宋从凤
TA3-13是小麦中一个冷胁迫蛋白WCSP1编码基因的5′端截短的DNA序列。它与水稻白叶枯病菌Harpin蛋白的编码基因hpa1_(X∞)(又称hrf1,hrfA)具有59%的一致性。为了研究TA3-13蛋白的生物学性状和功能及其与Harpin蛋白的关系,本研究以pET30a(+)为载体,构建了His融合表达重组体,转化大肠杆菌后在异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)和阿拉伯糖的诱导下获得了融合蛋白的表达。利用镍柱对融合蛋白进行了纯化研究,结果表明:融合蛋白在200 mmol·L~(-1)咪唑浓度下能够被有效地洗脱下来,电泳显示具有单一条带。烟草花叶病毒(TMV)接种试验显示:纯化的TA...
[期刊] 西南农业学报
[作者]
卿冬进 邓国富 戴高兴 潘英华 陆春菊 李经成 周维永 陈韦韦 梁海福 陈荣林
【目的】在大肠杆菌中过表达、纯化水稻冷胁迫响应蛋白OsCML16,同时制备OsCML16蛋白抗体提供抗原，为采用该抗体研究水稻OsCML16蛋白的生物学功能提供参考依据。【方法】采用TMHMM 2.0在线分析软件对目的蛋白OsCML16进行跨膜区分析，利用高保真PCR扩增目的基因片段，以基因重组方法构建原核表达载体pET30a-OsCML16,并将重组质粒转入大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)中；通过IPTG诱导OsCML16蛋白表达，然后采用亲和层析方法纯化获得目的蛋白，最后运用质谱验证法分析验证蛋白序列的真实性。【结果】通过对OsCML16蛋白跨膜区分析，发现该蛋白不包含跨膜结构，适合外源表达全长蛋白。将OsCML16基因链接至pET30a载体能成功构建原核表达载体pET30a-OsCML16,目的基因序列无突变位点，可用于表达目标蛋白。外源表达的OsCML16蛋白经过SDS-PAGE电泳分析，结果表明，OsCML16蛋白在28℃下可诱导表达，采用亲和层析方法纯化融合蛋白His_6-OsCML16-His_6,能成功获得分子量约30 kD的目的蛋白。对纯化的蛋白进行质谱验证分析，结果鉴定到3条多肽属于OsCML16蛋白，表明外源表达的蛋白即为OsCML16蛋白。【结论】采用原核表达方法将水稻冷胁迫响应基因OsCML16在大肠杆菌中表达，运用亲和层析技术根据融合蛋白携带组氨酸标签纯化获得融合表达蛋白His_6-OsCML16-His_6,并以蛋白质谱技术验证该蛋白的序列完全正确，后续可将水稻OsCML16蛋白用于抗体制备及蛋白功能研究。
[期刊] 沈阳农业大学学报
[作者]
刘倩 唐亮 谈立松 赵玉军
为获得鸡VEGF基因片段,原核表达GST-cVEG基因,并对融合蛋白进行分离纯化,应用RT-PCR从鸡睾丸中扩增出VEGF片段,将PCR产物克隆至pMD 18-T载体。随后,将cVEGF片段亚克隆至带有GST的原核表达载体pGEX-4T-2中,测序鉴定。将重组质粒pGEX4T2-cVEGF转化大肠杆菌BL21(DE3)菌株,IPTG诱导,并进一步通过Ni-NTA Agarose亲合层析纯化,纯化产物以SDS-PAGE和Western blot进行鉴定,结果表明,成功地构建了原核表达质粒pGEX4T2-cVEGF。GST-cVEGF融合蛋白在大肠杆菌中得到了表达,Ni-NTA Agarose纯化...
关键词：
cVEGF 融合蛋白 原核表达
[期刊] 水产学报
[作者]
苗亮 李明云 陈莹莹 胡谋 陈炯
为研究冷诱导结合蛋白(CIRP)在大黄鱼低温适应过程中的作用,采用同源克隆技术获得了大黄鱼CIRP基因,并通过实时荧光定量PCR(qRT-PCR)技术检测了低温胁迫下大黄鱼各组织中CIRP基因的表达变化。结果显示,大黄鱼CIRP基因cDNA序列全长1211 bp,推测编码一个由182个氨基酸组成、分子量为19 ku的蛋白。序列比对显示硬骨鱼类CIRP基因序列较为保守,特别是N端的RNA识别基序(RRM)高度保守。系统进化树分析显示大黄鱼CIRP与银鳕相似性最高(81.5%),所有硬骨鱼类聚为一个大支。慢性
[期刊] 福建农林大学学报(自然科学版)
[作者]
颜论 陈国建 陈明飞 游经番 彭姣姣 程春红
采用荧光定量PCR技术分析BjuFIP在不同非生物逆境胁迫下的表达模式.通过无缝克隆技术将BjuFIP的CDS序列构建到原核表达载体pGEX4T-1上，测序正确后转化大肠杆菌表达菌株BL21,对BjuFIP-GST蛋白进行体外诱导表达纯化.结果表明，BjuFIP-1显著受低温(4℃)、高温(37℃)和NaCl的诱导表达，BjuFIP-2显著受低温(4℃)、高温(37℃)、ABA、NaCl以及Mannitol的诱导表达，说明BjuFIP在调控榨菜响应非生物逆境胁迫过程中具有重要作用.SDS-PAGE电泳检测结果显示，在16、25和37℃以及1 mmol·L~(-1) IPTG诱导条件下，重组菌株均能够表达出分子质量约为55 ku的BjuFIP-GST融合蛋白，并且16℃诱导条件下，BjuFIP-GST蛋白较多以可溶性蛋白的形式存在，通过Glutathione Beads亲和层析柱纯化后，获得了大量纯度较好的BjuFIP-GST融合蛋白.BjuFIP显著受非生物逆境胁迫的诱导表达，在调控榨菜响应非生物逆境胁迫过程中具有重要作用，并且获得了大量纯度较高的BjuFIP-1-GST和BjuFIP-2-GST融合蛋白，为后期进一步探究BjuFIP在调控榨菜抗逆过程中的功能提供依据.
[期刊] 华北农学报
[作者]
付振艳 张正斌 王晓军 徐萍
NADP依赖的苹果酸酶(NADP-ME)是C4光合途径关键酶。为了确定TaNADP-ME1基因的功能,利用重组技术将前期克隆到的TaNADP-ME1基因构建到原核表达载体pET32a,双酶切和PCR鉴定阳性克隆,CaCl2法转化大肠杆菌BL21(DE3)pLysS,IPTG诱导融合蛋白表达,Ni2+-NTA琼脂糖亲和层析柱纯化融合蛋白。成功获得了重组原核表达载体pETE1,TaNADP-ME1基因在BL21(DE3)pLysS中得到了融合表达,SDS-PAGE表明,融合蛋白分子量为80 kDa,并成功纯化到融合蛋白。
[期刊] 华北农学报
[作者]
郭秀林 刘子会 赵会嶶 徐婧 李慧聪
小麦经过适当高温锻炼可产生获得耐热性,为揭示其分子生物学机理,选取耐热品种邯6172和热敏感品种石新733,对34℃热锻炼和42℃高温胁迫条件下叶片2个热激蛋白基因和6个抗氧化酶基因转录表达进行了荧光定量分析,并测定了热致死时间。结果显示,34℃热锻炼可不同程度地提高耐热品种和热敏感品种叶片的热致死时间,42℃高温胁迫下耐热品种表现出更强耐热性。34℃热锻炼可诱导耐热品种热激蛋白TaHsp70和TaHsp16.9基因在不同时间点出现不同程度表达高峰,植株遭受高温胁迫时基因表达上调幅度更强于热敏感品种。34℃热锻炼,耐热品种和热敏感品种Ta(Cu/Zn)SOD、TaMnSOD、TaApx1、Ta...
[期刊] 华北农学报
[作者]
王晓晔 石博妹 王英群 李珣 刘徳玉 李铭 李芳芳 胡传活
人工抗凋亡蛋白ＰＴＤ－Ｂｃｌ－ｘ ｌ能保护多种因素引起的细胞异常凋亡，为了获得高纯度Ｂｃｌ－ｘ ｌ与ＰＴＤ（ＰｒｏＴｅｉｎ ＴｒａｎｓＤｕｃＴｉｏｎ Ｄｏｍａｉｎｓ）的融合蛋白，首先采用Ｔｒｉｚｏｌ法提取ｓＤ大鼠肝脏总ｒｎａ，将ｒｎａ反转录为ｃ Ｄｎａ，设计引物以ｃ Ｄｎａ为模板，Ｐｃｒ扩增Ｂｃｌ－ｘ ｌ基因，构建Ｐ ｕｍ１９－Ｔ－Ｂｃｌ－ｘ ｌ质粒，并对质粒双酶切鉴定和测序鉴定；其次设计包含ＰＴＤ序列的Ｂｃｌ－ｘ ｌ引物，以测序正确的Ｐ ｕｍ１９－Ｔ－Ｂｃｌ－ｘ ｌ质粒为模板，Ｐｃｒ扩增ＰＴＤ－Ｂｃｌ－ｘ ｌ序列，将扩增序列克隆入Ｐ ｅＴ２８ａ载体，构建ＰＴＤ－Ｂｃｌ－ｘ ｌ蛋白的原核表达质．．．
[期刊] 中国农业科学
[作者]
杨婉莹 温硕洋 邓小娟 叶明强 夏庆友 曹阳 黄亚东
【目的】Drosomycin(Drs)是从黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)中鉴定发现的对丝状真菌有广谱抗性的抗真菌肽因子,此外,在黑腹果蝇基因组中,还存在另外6条Drs同系物的基因序列,对它们推导的氨基酸序列具有与Drs相同的保守位点和CSαβ模体结构。为鉴定Drs及其6个同系物的抗性功能差异,研究其分子结构与功能的关系,需要对这些同系物基因进行克隆表达,获得有生物学活性的纯化样品。【方法】本文采用PCR分段互补合成的方法准确地获得了Drs同系物基因,并克隆至pET-3C载体上,转化到宿主菌E.coli Origami(DE3)中进行诱导表达,表达产物经阳离子CM S...
[期刊] 中国水产科学
[作者]
许琼琼 韩兵社 罗军涛 李艳 侯艳雯 胡鹏 张俊芳
为了研究鱼类低温下分子调控机制及其与活性氧（ｒｅａｃｔｉｖｅ ｏｘｙｇｅｎ ｓｐｅｃｉｅｓ，ｒｏｓ）之间的关系，本实验对斑马鱼（Ｄａｎｉｏ ｒｅｒｉｏ）胚胎成纤维ＺＦ４细胞进行不同程度的低温胁迫（１８℃和１０℃），监测其在不同低温胁迫时间下（１ Ｄ、３ Ｄ和５ Ｄ）ｒｏｓ的变化以及丝裂原活化蛋白激酶（ｍｉｔｏｇｅｎ－ａｃｔｉｖａｔｅＤ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ，ｍａｐｋ）通路中蛋白的表达情况。结果显示：（１）ＤｃＦＨ－Ｄａ探针法表明在低温胁迫作用下，细胞内ｒｏｓ含量增加。细胞内ｒｏｓ上升水平与外界胁迫压力成正相关。低温处理３ Ｄ后，１８℃和１０℃的细胞，其ｒｏｓ含量与对照组（２８℃）相比分．．．
[期刊] 中国农业科学
[作者]
张瑞越 徐兆师 李连城 陈明 马有志
【目的】水分胁迫和低温是制约植物生长发育的重要限制因子,研究植物感知、传递胁迫信号,并对重要的基因进行克隆对改良作物的抗性有重要意义。本试验的目的是克隆与水分胁迫相关的基因,通过基因的功能进一步了解植物的抗旱机制,并为抗逆育种提供候选基因。【方法】试验应用噬菌体原位杂交技术从小麦旱胁迫cDNA文库中克隆了一个水分胁迫诱导基因片段W89。用5′-RACE和RT-PCR方法,获得了W89基因的全长序列。【结果】W89全长cDNA为2392bp,其中,编码区长1896bp,编码631个氨基酸。Southern杂交表明,W89是一个单拷贝基因。RT-PCR结果表明,W89受干旱、低温和ABA的诱导。氨...
关键词：
小麦 水分胁迫 低温 基因克隆
[期刊] 华北农学报
[作者]
李春子 成善汉
越来越多的研究表明,非生物胁迫影响植物的生长发育与栽培范围。为了通过转基因方法提高栽培番茄、马铃薯对热和干旱组合胁迫的抗性,利用RT-PCR结合RACE技术,从热处理的烟草叶片中分离出了细胞质小分子热激蛋白基因。分析表明,该基因cDNA全长876 bp,包含一个480 bp的开放阅读框,编码159个氨基酸,相对分子量约为17.8 kDa,被命名为Nt-HSP17.8。Northern杂交结果显示,该基因在烟草中的表达不仅受单一胁迫如热或干旱的诱导,而且在干旱与热组合胁迫下表达量大大增加,说明该基因在耐热与干旱交叉胁迫中起重要作用。
[期刊] 华中农业大学学报
[作者]
彭丽桃 李琼 刘合生 陈佩 丰明乾 潘思轶
植物硫化激动素(phytosulfokine-α,PSK-α)是植物体内一种小分子肽类生长调节因子,具有促进细胞增殖等多种生物活性。但由于其在植物体内的含量极低,难以满足PSK-α研究和应用的需要。笔者在前期构建PSK-α原核型表达载体的基础上,研究了影响融合蛋白表达的因素,优化了培养条件,并运用谷胱甘肽S-转移酶(glutathione S-transferase,GST)亲和柱层析对融合蛋白进行了分离纯化。通过单因素和正交试验的结果表明:培养温度、诱导剂浓度、诱导剂加入时机和诱导时间均对融合蛋白的表达量和表达形式有很大影响;在诱导温度20℃,扩大培养150 min(菌液培养至OD600值约...
关键词：
植物硫化激动素 表达条件 融合蛋白 纯化
[期刊] 中国农业科学
[作者]
任江萍 刘海伦 王新国 牛洪斌 李永春 王翔 陈新 尹钧
【目的】克隆与逆境胁迫相关的基因,通过对目的基因的表达分析进一步解析植物的抗逆机制,为小麦抗逆育种提供候选基因和理论依据。【方法】基于cDNA芯片数据获得的水分胁迫诱导上调表达基因EST序列,运用RACE技术进行cDNA全长克隆,采用生物信息学软件分析克隆基因的编码蛋白特性,并利用实时荧光定量PCR分析该基因在不同组织及不同胁迫处理条件下的表达模式【。结果】通过RACE扩增获得小麦cDNA全长序列(GenBank登录号:JN650603),命名为Ta14S。该基因序列全长为1 056 bp,其中,5′端非编码区11 bp,3′端非编码区253bp,开放阅读框为792 bp,编码263个氨基酸。...
关键词：
小麦 14-3-3蛋白 逆境胁迫 表达
[期刊] 渔业科学进展
[作者]
王凯琳 胡乔木 陈松林
通过对半滑舌鳎（Ｃｙｎｏｇｌｏｓｓｕｓ ｓｅｍｉｌａｅｖｉｓ）进行全基因组及转录组测序，预测了一个半滑舌鳎性别相关基因ＣｓＦＲ２，目前已对该基因进行了克隆和表达分析。为进一步研究ＣｓＦＲ２基因的功能，本研究从蛋白层面入手，构建了原核表达载体ｐ ｅＴ－３２ａ－ＣｓＦＲ２，转化到大肠杆菌ｅ．Ｃｏｌｉ进行诱导表达，用Ｈｉｓ ＴＲａｐ进行蛋白纯化，ｓＤｓ－ｐａｇｅ电泳检测诱导及纯化产物，并将表达纯化的ＣｓＦＲ２蛋白注射１龄半滑舌鳎精巢。由于ＣｓＦＲ２是一个性别相关基因，因此无法通过免疫反应来直接检测其蛋白活性，本研究通过不同时间点取样检测半滑舌鳎其他性别相关基因Ｃｙｐ１９ａ和Ｆｏｘｌ２的表达量变化，来．．．
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