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[期刊] 沈阳农业大学学报
[作者]
许诺 贾俊龙 王维 朱玉博 王雪晗 白文林 罗光彬
为探讨３种感染方法对不同发育阶段胚胎中ＥＧＦＰ基因表达影响，利用透明带下注射法、胞质内注射法及透明带切口与慢病毒共培养法感染１－细胞期小鼠胚胎，分别提取以上３种方法感染慢病毒的不同发育阶段胚胎的ＥＧＰＦ基因，并以其为模板，扩增出６３０ｂＰ的ＥＧＰＦ基因片段。结果表明：慢病毒转染后在不同发育阶段的胚胎中，均扩增出ＥＧＦＰ目的片段（６３０ｂＰ）。当透明带下注射病毒时，９０Ｐ Ｌ注射组（Ｃ组）和６０Ｐ Ｌ注射组（ｂ组）的ＥＧＦＰ基因阳性率显著优于３０Ｐ Ｌ注射组（Ａ组）（Ｐ＜０．０５）。当胞质注射病毒时，Ｃ组显著优于其他组（Ｐ０．０５）。透明带．．．
关键词：
慢病毒 胚胎 EGFP 体外表达
[期刊] 沈阳农业大学学报
[作者]
王雪晗 贾俊龙 王维 朱玉博 许诺 白文林 罗光彬
为筛选出最佳的慢病毒转染处理时间，研究三质粒对慢病毒包装的最佳浓度配比，以及对２９３Ｔ细胞的细胞转染率和滴度，通过脂质体与Ｆｕｇｗ质粒混合后转染２９３Ｔ细胞，观察２９３Ｔ细胞的形态和荧光表达量。结果表明：转染６ｈ组的细胞形态略好于８ｈ；转染８ｈ组和６ｈ组的转染率均极显著高于１０ｈ组（ｐ０．０５）；质粒配比为４：３：２时，慢病毒滴度最高，达３．７９５×１０７Ｔｕ·ｍ Ｌ－１，经离心后滴度与离心之前相比能提高１００倍。不同浓度的质粒配比对２９３Ｔ细胞转染率和滴度方面，Ｂ组（４∶３∶２）的转染率最高、Ｃ组（３∶２∶１）最低、Ａ组（５∶４∶３）介于二者之间，３组间．．．
关键词：
慢病毒 转染 293T细胞 滴度
[期刊] 中国农业科学
[作者]
金梅 康琳 孙东禹 朴君 朴敬爱 赵凤琴
【目的】利用慢病毒介导过表达技术,明确小鼠K26和KAP26.1基因过表达后对角蛋白关联蛋白基因KAP6.2、KAP7.1、KAP8.2、KAP11.1和对骨形态发生蛋白基因BMP-4、BMPR-IB的影响,探究小鼠绒毛细度变化的影响机制,达到人为调控(如慢病毒载体技术)使相关基因过表达,改善动物绒毛品质的目的,为哺乳动物绒毛细度调控的研究奠定理论基础,【方法】试验在辽宁省生物技术与分子药物研发重点实验室完成,小白鼠采自大连医科大学实验动物中心,选取出生后5周龄昆明种雄鼠。在Genebank查找到小鼠基因
[期刊] 华北农学报
[作者]
李运生 杨宏星 刘晓蕊 习海涛 方富贵 刘亚
为探明Ghrelin及其受体Ghsr-1a在早期胚胎发育中的作用,以小鼠体内受精、体外受精和孤雌激活胚胎为研究对象,在其体外发育过程中添加不同浓度Ghrelin,观察胚胎发育效率;通过免疫荧光染色和荧光定量PCR,观察不同时期胚胎中Ghsr-1a的变化。结果表明,体内受精胚体外发育中添加0.1 ng/m L Ghrelin显著降低了囊胚率(P<0.05)。在体内受精胎中,Ghsr-1a的mRNA表达水平在4细胞显著高于其他时期(P<0.05);体外受精胚中,Ghsr-1a的mRNA水平在8细胞前无明显差异,桑...
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
辛颖 张涛 张优优 张智英
【目的】用慢病毒在体内感染精原干细胞,建立转基因动物生产技术平台。【方法】用三质粒慢病毒载体系统转染293T细胞包装慢病毒,转染后裂解细胞,收集携带绿色荧光蛋白(EGFP)基因的慢病毒。将慢病毒液注射到小鼠曲细精管,获得F0代小鼠,制备小鼠睾丸组织切片,进行免疫双荧光检测。将F0代小鼠与野生型母鼠交配,获得F1代小鼠,PCR检测F1代是否为转基因小鼠。【结果】通过裂解细胞的方法成功制得慢病毒,将其注射到小鼠曲细精管,获得了10只F0代小鼠,经免疫双荧光检测,发现慢病毒可在活体上感染精原干细胞。8只F0代小鼠与野生型母鼠交配后共获得了41只F1代小鼠,经PCR检测,21只携带慢病毒基因片段,转基...
关键词：
慢病毒 活体 精原干细胞 转基因小鼠
[期刊] 中国农业大学学报
[作者]
王建舫 曲伟杰 吴培福 吴清民 刘金华 韩博
为探讨氟化钠对小鼠成骨细胞中核因子-κB受体活化因子配体(RANKL)和骨保护素(OPG)mRNA表达比率的影响,选取新生小鼠颅盖骨,用胰蛋白酶-胶原酶消化法分离培养成骨细胞。取其第3代成骨细胞,在实验组培养液中加入不同浓度的氟化钠(10-7、10-6和10-5mol/L),并分别培养24、48、96和144 h,从细胞板贴壁细胞中提取总RNA,应用荧光定量RT-PCR方法检测细胞中RANKL与OPG mRNA表达比率的变化。结果显示,氟化钠增加了RANKL/OPG mRNA的表达比率,且呈明显的时间剂量效应关系。对照组和实验组在培养48 h时,RANKL与OPGmRNA的表达比率显著增加(P...
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
马增友 秦歌 郑浩懿 卢郑坤 张文昌 彭辉
[目的]研究TRIM8基因在小鼠组织和早期胚胎中的表达情况及其沉默后对早期胚胎体外发育的影响。[方法]采用RT-PCR、免疫印迹分别检测TRIM8基因及其编码的蛋白在小鼠不同组织(心、肝、脾、肺、肾、胃、肠、肌肉、子宫、卵巢和睾丸)中的表达情况,采用免疫组化技术对TRIM8在卵巢中进行定位。利用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)、免疫印迹法检测TRIM8基因及其编码的蛋白在小鼠早期胚胎(1-细胞胚胎、2-细胞胚胎、4-细胞胚胎、8-细胞胚胎、桑葚胚和囊胚)中的表达规律,用免疫荧光结合激光共聚焦显微镜技术对TRIM8在早期胚胎中进行定位。利用RNA干扰技术沉默TRIM8基因,研究该基因沉默对小鼠早期胚胎体外发育的影响。[结果]TRIM8基因及其编码的蛋白在小鼠不同组织中均表达,但在子宫、卵巢和睾丸中表达水平相对较高。在卵巢中,TRIM8蛋白主要定位在不同发育阶段的卵母细胞中。TRIM8基因及其编码的蛋白在早期胚胎中均有表达,但其mRNA表达水平在1-细胞到4-细胞期胚胎中的表达水平显著高于8-细胞到囊胚期胚胎。TRIM8蛋白主要定位在不同时期胚胎的胞质中。TRIM8基因沉默组的囊胚率显著低于对照组(P<0.05)。[结论]TRIM8基因及其编码的蛋白在小鼠各组织及早期胚胎中均有表达,主要定位在早期胚胎的胞质中;沉默TRIM8基因会显著降低囊胚发育率。TRIM8可能参与调控小鼠早期胚胎的发育进程。
[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
邵根宝 高爱民 徐银学 丁红梅 贾超 刘红林
利用实时定量RT-PCR技术,对体外培养的小鼠植入前胚胎发育过程中鼠内源逆转录病毒样基因(MuERV-L)的表达进行研究,并通过appd icolin(DNA复制抑制剂)、TSA(组蛋白去乙酰化酶特异性抑制剂)分别抑制1-细胞期DNA的复制和合子基因组激活(ZGA)过程中组蛋白去乙酰化,探索MuERV-L基因表达的变化。结果表明:MuERV-L基因的转录在受精后9~11 h快速启动,并在2-细胞阶段出现瞬时高表达。抑制试验显示:1-细胞期DNA的复制受抑制后,MuERV-L基因的转录也被显著抑制(P<0.05);在TSA处理的4-细胞胚胎中,MuERV-L基因显著高表达(P<0.01),且其水...
[期刊] 上海海洋大学学报
[作者]
盛佳璐 宗乾坤 喻飞 王浩 吕利群
草鱼Ⅱ型呼肠孤病毒是当前引起我国草鱼出血病的主要流行毒株,VP56是其外层衣壳上的唯一突起蛋白并有可能在病毒入侵阶段发挥核心作用,但该蛋白的具体功能尚不清楚。为了探讨VP56的生物学功能,分别利用大肠杆菌原核表达系统和杆状病毒真核表达系统研究了VP56的体外表达特性。首先从GCRVJX02W株的细胞感染混合物中抽提总RNA,并通过RT-PCR方法获得目的基因VP56,分别克隆至pGEX-4T-3及pFastBacHTA载体上,将质粒pGEX-4T-3-VP56转化至BL21(DE3),经IPTG诱导后,成功表达融合蛋白GST-VP56,大小为83ku,以包涵体形式存在;蛋白经纯化后免疫老鼠,制备了VP56的多克隆抗体,可以和rVP56产生特异性免疫结合。将pFastBacHTA-VP56转化至DH10Bac,成功转座后,提取重组杆粒DNA并鉴定且测序正确后转染SF9昆虫细胞。结果表明,自转染96h起,转染杆粒的细胞生长停滞,不断裂解。Westernblot结果显示,细胞表达重组蛋白His-VP56,大小约为62ku,为可溶蛋白。本研究利用原核表达系统和真核表达系统体外表达了VP56蛋白,制备了抗VP56多克隆抗体,为深入研究VP56蛋白在病毒入侵时的生物学功能奠定了基础。
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
李玲玲 张伟 杜蕊 宋玲珍 柴学军 胡新德 陈树林 赵善廷
【目的】构建能够在神经系统中高效表达的小鼠cofilin-1野生型(Cfl1-wt)、活化型(Cfl1-S3A)、失活型(Cfl1-S3D)3种真核表达载体,并研究其在鸡胚脊髓神经元中的表达情况,为进一步探讨cofilin-1在大脑发育过程中对神经元迁移的影响奠定基础。【方法】从成年小鼠大脑组织中提取RNA,经反转录获得cDNA样本,RT-PCR扩增小鼠cofilin-1基因的CDS区,经引物设计引入点突变,扩增了野生型、活化型及失活型的cofilin-1基因片段,克隆入pCAG-MCS-myc真核表达载体中。经双酶切和测序鉴定后,转染CHO细胞,通过半定量RT-PCR和免疫荧光染色检测其在细...
[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
徐世永 丁红梅 孙岩 王蒙 蔡亚飞 刘红林
以增强型绿色荧光蛋白(EGFP)为标记基因构建复制缺陷型慢病毒载体生产病毒,以病毒感染不同来源、不同分化特征的细胞,并进行鸡囊胚注射,观测外源基因的表达情况。试验结果表明,在所有类型细胞中均可检测到EGFP较高水平的表达,其中在HeLa、293FT细胞中的转染效率约1×108TU.mL-1(TU:转染单位),在C127细胞中为5×107TU.mL-1,在鸡胚胎成纤维细胞(CEF)中约为1×106TU.mL-1,病毒在鸡原生殖细胞(cPGC)中转染效率最低为1×102TU.mL-1。病毒的感染可引起细胞表型的不利改变。用该病毒载体注射鸡囊胚获得了可直接活体观察绿色荧光信号的转基因鸡,转基因效率约...
[期刊] 西南农业学报
[作者]
覃鸿妮 谢钰珍 陈罡 密苗苗 彭赛男 张勇
【目的】通过慢病毒转染细胞构建稳定表达CRISPR/Cpf1的293 T和HT 1080细胞系,实现高效率基因编辑。【方法】PCR扩增AsCpf1和LbCpf1基因片段,酶切后克隆到慢病毒载体pLent-EF1a-MF-CMV-GFP-P2A-Puro上,将该质粒与慢病毒包装质粒psPAX2、pMD2.G共转染293FT细胞,通过抗性和荧光标记筛选得到稳定表达LbCpf1和AsCpf1的细胞系,并对单克隆细胞进行DNA、RNA特异性和反转录验证。用设计好的针对ABCG1基因的sgRNA转染单克隆细胞,通过DNA特异性和T7E1酶切验证基因敲除效率。【结果】成功构建了Cpf1-pLent慢病毒载体,重组载体对293 FT细胞进行慢病毒包装、浓缩与纯化后,病毒滴度均在10~6 TU/mL之上。用纯化后的病毒感染293 T和HT 1080细胞,筛选出3株能稳定表Cpf1的细胞系,目的ABCG1基因的基因编辑功能验证表明其中2株T7EΙ酶切掉带明显,sgRNA靶向敲除效率较高,命名为AsCpf1-293 T-7D和AsCpf1-HT1080 02-3B。【结论】建立了稳定表达Cpf1的293T和HT 1080细胞细胞系,可以用于目的基因的高效敲除。
[期刊] 华中农业大学学报
[作者]
方六荣 肖少波 谢京国 潘永飞 姚林 陈焕春
对西门利克森林病毒(SFV)复制子质粒型表达载体pSFV1进行改造,即在SFV非结构蛋白(nSPs) 上游插入依赖于RNA聚合酶Ⅱ的人巨细胞病毒立即早期启动子/增强子序列(hCMV IE Pro/Enh),同时在pS- FV1的多克隆位点下游插入SV40 poly(A)终止信号序列,获得可以完全在DNA水平上操作并具有自主复制功能的表达载体pSFV-DNA。为了进一步探讨改造载体的转染效率、表达能力以及是否能诱导细胞凋亡等特性, 将报告基因EGFP插入pSFV-DNA中亚基因组启动子下游,构建的重组表达质粒pSFV-EGFP转染BHK-21 细胞,转染后12 h即可观察到荧光,但转染效率明显低...
[期刊] 上海海洋大学学报
[作者]
张昭 朱四东 井晓欢 杨季芳 陈吉刚
锯缘青蟹呼肠孤病毒(Scylla serrata reovirus,SsRV)第9节段(S9)编码的p40蛋白可能为病毒的甲基转移酶(methyltransferase)。为了便于确认p40在病毒复制过程中扮演的角色,将S9片段的开放阅读框(ORF)克隆到原核表达载体pET28a(+),实现了在宿主表达菌E.coli BL21(DE3)中的高效表达,进而纯化了重组表达蛋白p40(rp40),并制备了抗SsRV p40蛋白的2株单克隆抗体(4B7、3E5)。经Western blot分析表明,2株单克隆抗体均可特异地识别rp40蛋白,以及识别SsRV病毒蛋白中分子量为46 ku和40 ku 2条...
[期刊] 中国农业大学学报
[作者]
刘思雨 张月莹 黄江 崔月琦 刘宇 周玉龙 朱战波 张泽财
为分析小鼠感染牛病毒性腹泻病毒（Bovine viral diarrhea virus,BVDV）诱导的NLRP3炎症小体表达情况及其对病毒复制的影响，选用40只4～6周龄雌性SPF级BALB/c小鼠，随机分成8组，其中BVDV接种小鼠7组，对照1组，每组5只。应用105 TCID50的CP型BVDV腹腔感染小鼠后，分别在感染后0、6、12、24、48、96、168和240h采集小鼠的肠道、脾脏和血液，通过qRT-PCR和Western Blot方法对小鼠十二指肠中NLRP3、IL-1β和Caspase-1分别进行基因及蛋白水平的检测。应用qRT-PCR方法确定不同时间点小鼠十二指肠和血液中的病毒载量，同时于感染后第168h检查十二指肠和脾脏病理组织变化。结果表明：1）小鼠感染BVDV早期（6、12和24h）组织中的NLRP3、IL-1β和Caspase-1基因转录水平逐步升高，48h未见明显变化，同时感染24h时，蛋白表达水平均显著高于对照组（P<0.05）;2）小鼠感染BVDV后期（96、168和240h）NLRP3、IL-1β和Caspase-1的基因转录水平呈现下降趋势，168h时转录和蛋白水平降低最为显著（P<0.05）;3）感染小鼠十二指肠、脾脏和血液的病毒载量均在168h达到高峰；第168h采集的小鼠十二指肠有大量炎性细胞浸润，脾脏淋巴细胞变性和坏死，证明BVDV感染模型成立。综上，NLRP3炎症小体在BVDV感染早期被激活，然而，随着病毒载量的增加，可能对其活性有一定的抑制作用。
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