为克隆意大利蜜蜂（Apis mellifera ligustica）的AmMETTL3基因，解析AmMETTL3蛋白的分子特性，并测定AmMETTL3在工蜂不同组织及发育时期的表达谱。通过PCR扩增AmMETTL3的CDS并进行Sanger测序验证；使用相关生物信息学软件预测AmMETTL3的理化性质和分子特性，鉴定METTL3的结构域和保守基序，并构建系统进化树；采用RT-qPCR检测AmMETTL3在工蜂7个组织及5个不同发育时期的相对表达量。结果表明：成功克隆到AmMETTL3的CDS并发现AmMETTL3不含典型的跨膜结构域和信号肽；METTL3在各种昆虫中高度保守且含1个MT-A70结构域和3个相同的保守基序；AmMETTL3与东方蜜蜂METTL3的亲缘关系最近；相较于触角中的表达量，AmMETTL3的表达量在咽下腺中极显著上调（P<0.01），在中肠中极显著下调（P<0.01）;AmMETTL3在3日龄幼虫中的表达量极显著（P<0.01）低于卵中的表达量，在12日龄蛹中的表达量极显著（P<0.01）高于卵中的表达量，在2、6、12、15和18日龄工蜂体内的表达量极显著（P<0.01）低于1日龄工蜂体内的表达量。研究结果为深入探究AmMETTL3的功能及其参与的表观调控机制提供了参考和依据。

【背景】作为我国本土重要的资源昆虫，中华蜜蜂（Apis cerana cerana，简称中蜂）对我国初冬季低温开花植物的传粉具有重要的生态价值，其传粉习性与嗅觉系统密切相关。前期对中蜂采集蜂高、低温处理后的触角转录组数据分析发现，与昆虫嗅觉相关的尼曼匹克C2型蛋白（Niemann-Pick type C2 protein,NPC2）基因家族在低温时表达量上升。【目的】以中蜂NPC2家族基因为研究对象，克隆并分析其结构特征和表达谱以及高、低温处理下表达量的差异，为深入研究中蜂NPC2基因家族在中蜂低温适应的嗅觉感受功能提供参考。【方法】基于中蜂高、低温转录组测序结果，利用RT-PCR克隆获得中蜂NPC2基因ORF序列，进行系统进化树分析和三维结构预测，然后通过实时荧光定量PCR分析中蜂NPC2基因在不同发育时期、组织的时空表达谱，以及高、低温时的表达量变化。【结果】获得4个中蜂NPC2基因——AcNPC2a、AcNPC2b、AcNPC2c、AcNPC2d的ORF全长，分别为447、480、459和465 bp，编码148、159、152和154个氨基酸，预测蛋白分子量为16.12—18.53 kD，等电点分别为7.98、7.57、6.56和6.34。进化树分析显示AcNPC2与意大利蜜蜂的NPC2同源序列亲缘关系最近，与其他膜翅目昆虫NPC2也有一定相似性。实时荧光定量PCR结果显示，AcNPC2a在新出房蜂的腹部表达量最高，其次是在哺育蜂的腹部以及幼虫期；AcNPC2b在新出房蜂的胸部表达最高，在采集蜂的头部、胸部和后足也有表达；AcNPC2c在哺育蜂和采集蜂的触角中呈高丰度表达；AcNPC2d在采集蜂的头部表达量最高。经低温处理后，4个AcNPC2基因在采集蜂触角中的表达量均有所上升，但差异不显著。【结论】AcNPC2具有NPC2蛋白的保守结构，其基因家族成员在中蜂的时空表达谱中呈现多样性，其中AcNPC2c在触角中呈高丰度表达，表明其与中蜂嗅觉感受功能关系密切。AcNPC2基因家族在低温时采集蜂触角中表达量均有所上升，表明该基因家族有可能参与中蜂的低温适应性，或与初冬季访花行为有关。

【目的】克隆中华蜜蜂（Ａｐｉｓ ｃｅｒＡｎＡ ｃｅｒＡｎＡ）的ｃ ＡＭｐ反应原件结合蛋白（ｃ ＡＭｐ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｅｌｅＭｅｎｔ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ，ｃｒｅｂ）基因全长ｃ ｄｎＡ序列，预测该基因及其编码蛋白的理化性质，并解析中华蜜蜂ｃｒｅｂ在大脑中的表达特征，为研究该基因在中华蜜蜂学习记忆过程中的生物学功能提供基础。【方法】以中华蜜蜂为试验材料，解剖其大脑获得脑组织，提取大脑组织的总ｒｎＡ。在此基础上，利用ｒｔ－ｐｃｒ技术克隆中华蜜蜂大脑的ｃｒｅｂ基因（Ａｃ ｃｒｅｂ），然后用ｄｎＡｓｔＡｒ软件中的ｓｅｑＭＡｎ程序将ｃｒｅｂ正反向测序后的序列拼接获得ｃｒｅｂ基因的ｃ ｄｎＡ序．．．

为探究中华蜜蜂磁响应基因的生物学功能，提取中华蜜蜂Apis cerana cerana(简称中蜂)总RNA,反转录制备cDNA,用特异性引物PCR扩增AcMagR和AcCry2基因的CDS序列，利用生物信息学软件对其功能结构域、系统进化树等进行分析；采用实时荧光定量PCR技术(qPCR)分析中蜂工蜂不同日龄(1、5、10、15、20、25、30日龄)和不同组织(头部、胸部和腹部)中AcMagR和AcCry2基因的相对表达量.结果表明，中蜂AcMagR和AcCry2基因的ORF序列长分别为393、1 713 bp,分别编码130、570个氨基酸.AcMagR蛋白存在1个Fe-S＿biosyn功能结构域，AcCry2蛋白则具有2个功能结构域(DNA＿photolyase和FAD＿binding＿7).系统发育树显示，中蜂AcMagR、AcCry2基因与西方蜜蜂关系最近，它们再进一步与小蜜蜂和大蜜蜂聚为一支.荧光定量PCR结果表明，AcMagR和AcCry2基因在不同日龄工蜂胸部的表达量显著高于头部和腹部，且在采集蜂胸部中表达量最高，该结果表明这两个基因在蜜蜂的采集飞行活动中发挥着重要作用.

【目的】完成中华蜜蜂(Apis cerana cerana)化学感受蛋白(chemosensory proteins,CSPs)基因家族的序列及表达谱鉴定,解析中蜂整个CSPs家族的表达特征与分布规律,为中蜂CSPs的生物学功能研究提供参考。【方法】利用RT-PCR技术扩增,克隆获得中蜂CSPs基因家族全部6条基因序列的开放阅读框(ORF)全长,并利用real-time PCR技术对中蜂所有的CSPs序列在中蜂工蜂不同发育历期及不同器官表达特征进行研究。【结果】新克隆4条基因(Ac-CSP2、Ac-CSP4、Ac-CSP5和Ac-CSP6)的开放阅读框分别为354、387、315和378 bp...

［目的］通过表达载体ｐ ＥＴ－２８ａ（＋）在大肠杆菌中克隆表达蜜蜂螺原体ＳｐｉｒｏｐｌａＳｍａ ｍＥｌｌｉｆＥｒｕｍ ＣＨ－１中可能与致病相关的几丁质脱乙酰酶（ＣＨｉＴｉｎ ｄＥａＣＥＴｙｌａＳＥ，Ｃｄａ）基因ＣＨｉｄ，并测定其部分酶学性质，为进一步研究该基因在蜜蜂螺原体致病过程中的作用奠定基础。［方法］利用ｏｖＥｒｌａｐ ＥｘＴＥｎＳｉｏｎ ｐＣｒ（ｏＥ－ｐＣｒ）定点突变技术，在引物设计时插入目的突变，通过３次ｐＣｒ获得突变后的目的片段，测序验证后构建重组质粒ｐ ＥＴＣＨｉｄ，挑取ＢｌＣＨｉｄ表达菌株。ｉｐＴＧ诱导表达目的蛋白，ｎＴａ－ｎｉ２＋柱纯化，ＷＥＳＴＥｒｎ ＢｌｏＴＴｉｎＧ验证，紫．．．

【目的】克隆获得中华蜜蜂（Ａｐｉｓ ｃｅｒＡｎＡ ｃｅｒＡｎＡ）Ａｃｅｒ ＯＢｐ１４基因序列，并对其蛋白结构进行预测，分析其在不同组织和发育阶段的时空表达差异，为该基因的功能研究提供参考。【方法】以中华蜜蜂全组织ｃ ＤｎＡ为模板利用ｒＴ－ｐｃｒ技术扩增和克隆获得Ａｃｅｒ ＯＢｐ１４ ｃ ＤｎＡ全长序列，并提交至Ｇｅｎ ＢＡｎｋ数据库；利用多种生物信息学软件预测分析其编码蛋白的理化特性和结构特征；采用ＭｅＧＡ５．２软件中的邻位相连法（ｎｅｉＧｈＢＯｒ－ｊＯｉｎｉｎＧ，ｎｊ）构建Ａｃｅｒ ＯＢｐ１４及其同源膜翅目昆虫ＯＢｐｓ的系统发育树；通过实时荧光定量ｐｃｒ技术分析Ａｃｅｒ ＯＢｐ１４在１、５、．．．

克隆滩羊脂肪肥胖相关基因(FTO)的编码区序列(CDS),采用生物学软件和在线预测工具对FTO基因进行分子特征分析，通过实时荧光定量PCR检测FTO基因mRNA在滩羊各组织以及不同绵羊群体背最长肌中的表达水平，为研究FTO基因在滩羊及其杂交后代的生产性能以及新品种选育提供参考数据。结果表明：滩羊FTO基因CDS全长1 560 bp,编码519个氨基酸，存在1个错义突变，导致缬氨酸突变为蛋氨酸；滩羊FTO蛋白为亲水性蛋白，不存在跨膜结构，在第33～34氨基酸残基处具有信号肽；构建的系统发育进化树显示，滩羊与山羊的亲缘关系最为接近。FTO基因mRNA在滩羊背最长肌中的表达水平最低，在不同绵羊群体背最长肌中的表达水平存在显著差异，表达水平表现为：杜泊羊>杜滩寒杂交一代>滩羊>小尾寒羊；肉用绵羊(杜泊羊)FTO基因mRNA的表达水平相对高于其他非肉用品种。

本研究基于转录组学的分析结果，克隆分析了银鲳(Pampus argenteus)二肽酶(dehydropeptidase， dp1)、羧肽酶A (carboxypeptidases， cpa2l)和磺基转移酶(sulfotransferase， sult2) 3个营养代谢相关基因，并探讨了其在消化吸收水母(Scyphozoa)过程中发挥的功能。通过RACE技术克隆获得了银鲳dp1、cpa2l和sult2基因的cDNA全长序列。dp1基因全长2 522 bp，包含1个1 272 bp的开放阅读框(ORF)，含有1个由23个氨基酸组成的信号蛋白肽和1个典型的酰胺水解酶超家族的结构域。cpa2l基因全长1421 bp，ORF长1260 bp，含有1个由16个氨基酸组成的信号蛋白肽和1个典型的M14金属羧肽酶家族的结构域。sult2基因全长1 834 bp，ORF长714 bp，含有1个典型的磺基转移酶家族的结构域。银鲳Dp1、Cpa2l和Sult2与蓝鳍金枪鱼(Thunnus maccoyii)同源性最高，系统进化树结果也显示，银鲳dp1、cpa2l和sult2和蓝鳍金枪鱼对应基因聚在一个分支上，亲缘关系最近。运用实时荧光定量PCR (RT-qPCR)检测了dp1、cpa2l和sult2基因在不同组织中的表达水平及摄食水母对3个基因不同组织中表达规律的影响。结果发现，银鲳dp1基因在肝脏中表达量最高(P<0.05)，与未摄食水母组相比，dp1基因在摄食水母组的脑和鳃中表达量均极显著增加(P<0.01)，在中肠和肾脏中显著增加(P<0.05)，而在肌肉中显著下降(P<0.05)。cpa2l基因在未摄食水母组的中肠的表达量最高，而在摄食水母组的肾脏的表达量最高(P<0.05)，与未摄食水母组相比，摄食水母组cpa2l基因在肝脏中的表达量极显著增加(P<0.01)，而在中肠和肌肉中却极显著下降(P<0.01)。sult2基因在肝脏中表达量最高(P<0.05)，与未摄食水母组相比，sult2基因在摄食水母组的中肠、脑、鳃、肝脏和肾脏中表达量显著增加(P<0.05)。上述结果表明，dp1、cpa2l和sult2基因在银鲳摄食水母后机体营养物质的消化吸收和代谢过程中起重要的调节作用，基于摄食水母后3个基因组织表达模式的比较分析，推测dp1主要参与调控消化吸收和组织中营养素沉积的过程，cpa2l主要参与调控肝脏中营养代谢的过程，而sult2可能在整个消化吸收和代谢过程中均起到重要的调控作用。

【目的】克隆、分析和原核表达编码中华蜜蜂气味结合蛋白ASP2的cDNA。【方法】以13个不同日龄中华蜜蜂工蜂触角为材料,通过RT-PCR技术以获得编码中华蜜蜂Apis cerana cerana气味结合蛋白ASP2基因成熟蛋白开放阅读框序列,并在pET-30a(+)/BL21(DE3)系统中进行原核表达。【结果】克隆了命名为Acer-ASP2(GenBank登录号:DQ449667)的中华蜜蜂气味结合蛋白ASP2基因,该序列全长429bp,编码142个氨基酸残基,预测分子量和等电点分别为15.7kD和4.36。预测蛋白具有昆虫气味结合蛋白典型的6个保守的半胱氨酸残基的特征,进一步分析表明Ace...

通过反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)结合如cDNA末端快速克隆(RACE)技术从光皮桦Betula luminifera中克隆到1个FT类似基因,命名为BlFTL。该基因cDNA全长为924 bp(GenBank登录号:JQ951966),包含1个525bp的开放阅读框(116~640 bp),编码1个含174个氨基酸的蛋白,且具有FT蛋白典型的磷脂酰乙醇胺结合蛋白(PEBP)结构域。与已有部分植物中FT蛋白同源比对结果显示,BlFTL与无花果Ficus carica中FcFT序列相似性最高,达到了94%。4月为光皮桦开花期,雌花中BlFTL基因的表达量最高,茎和叶片中表达量很低。比较正...

【目的】TIR1/AFB F-box作为生长素受体参与从生长素结合到Aux/IAA蛋白降解这一信号转导过程。通过克隆杨树AFB基因家族成员,并检测其在病原菌、激素和干旱胁迫下的表达模式,以期了解AFB基因在杨树生长发育及激素信号转导中的作用机制。【方法】以美洲黑杨杂种NL-895杨为材料,通过PCR与RACE技术,克隆NL-895杨AFB基因家族成员全长c DNA,进而利用在线分析软件和数据库对各成员编码蛋白质的理化参数、保守结构域、蛋白质三级结构进行分析和预测;根据氨基酸序列多重比对结果进行系统进化分析;采用实时定量PCR技术研究4个NL-895杨AFB基因家族成员在病原菌、激素和干旱胁迫下...

【目的】前期已对意大利蜜蜂(Apis mellifera ligustica,简称意蜂)7日龄工蜂中肠(Am7)、10日龄工蜂中肠(Am10)进行全转录组测序,本研究基于高质量的组学数据探究中肠发育过程中的差异基因表达谱及其调控网络,以期解析意蜂工蜂中肠发育的分子机理。【方法】根据FPKM(fragments per kilobase of transcript per million mapped reads)算法计算基因表达量,并以|log2 fold change|≥1且P≤0.05作为标准筛选得到差异表达基因(differentially expressed gene,DEG)。利用TargetFinder软件预测ame-miR-6001-3p的靶mRNA。利用相关生物信息学软件,对全部DEG进行GO和KEGG数据库注释。筛选出与AMPK、P13K-Akt、Wnt、cAMP、FoxO、Hippo、mTOR、Jak-STAT、Toll-like受体、TGF-beta、Notch、MAPK和NF-κB 13条信号通路存在富集关系的DEG,以及与ame-miR-6001-3p存在靶向结合关系的DEG,通过Cytoscape软件构建调控网络将其富集关系与调控关系可视化。利用茎环反转录PCR(Stem loop RT-PCR)和实时荧光定量PCR(RT-qPCR)验证ame-miR-6001-3p以及DEG在Am7和Am10中的差异表达情况。【结果】Am7 vs Am10比较组中共有1 038个DEG,包括515个上调基因和523个下调基因。这些DEG涉及细胞进程、代谢进程和催化活性等功能条目,并显著富集在氧化磷酸化、氨基糖与核苷酸糖代谢、脂肪酸代谢和嘌呤代谢等能量和物质代谢通路,表明工蜂中肠内存在旺盛细胞生命与新陈代谢活动。表达量聚类分析发现分别有20、18、15和14个DEG富集在AMPK信号通路、P13K-Akt信号通路、内吞作用和Hippo信号通路。57个DEG与P13K-Akt、Wnt、Jak-STAT等上述13条与生长发育和免疫防御相关的信号通路存在富集关系,且1个DEG可与多条信号通路存在富集关系。调控网络分析结果显示,分别有54个上调基因和44个下调基因可被ame-miR-6001-3p靶向结合;上调基因富集在磷酸肌醇代谢、胰岛素信号通路、Hippo信号通路和谷胱甘肽代谢等43条代谢通路,而下调基因富集在Hippo信号通路、新陈代谢途径、谷胱甘肽代谢和花生四烯酸代谢等20条代谢通路。RT-qPCR结果显示随机挑选的6个DEG的表达量变化趋势与测序数据一致,证实了本研究中基因差异表达真实可靠。此外ame-miR-6001-3p在Am7和Am10内均真实表达,并在Am10中的相对表达量显著较低。【结论】对意蜂工蜂中肠发育过程的DEG表达谱和DEG与ame-miR-6001-3p之间的调控关系,以及DEG的潜在作用进行深入分析和探讨,发现DEG可参与TGF-beta、Wnt、Hippo、Notch、PI3K-Akt、mTOR、AMPK和NF-κB等各类信号通路进而影响中肠的生长发育和免疫防御,DEG可通过与显著下调表达的ame-miR-6001-3p形成复杂的调控网络参与意蜂工蜂中肠发育过程中胰岛素信号通路等多条代谢途径。

原花青素是植物中广泛存在的一类黄酮类化合物，是人类膳食的重要营养成分，在防治病虫害方面也发挥着重要作用，花青素还原酶(ANR)是合成原花青素的关键酶。以大果球红花品种为材料，克隆得到2个CtANR基因。生物信息学分析表明，CtANR2和CtANR3的编码区分别为1 020,1 023 bp,对应基因组序列中均含有5个外显子和4个内含子，第1个外显子长度不同，其余4个外显子长度一致，内含子长度差异较大。CtANR2和CtANR3基因编码蛋白质的氨基酸数目分别为339,340个，二级结构都主要由α-螺旋和无规则卷曲构成，都属于水溶性蛋白，但CtANR2蛋白不稳定，而CtANR3为稳定的亲水性蛋白。此外，2个蛋白质都不存在信号肽和跨膜结构，可能定位于细胞外。序列比对及系统进化分析表明，CtANR2和CtANR1同源性最高，亲缘关系最近，3个CtANR蛋白与菊科植物ANR蛋白进化关系最近，与茄科、锦葵科和桑科植物ANR蛋白也同属一个大分支。组织特异性表达分析发现，CtANR2和CtANR1组织表达模式相似，都是在花中的表达量最高，初期果球表达量最低，而CtANR3则在苞片中表达量最高，根和初期果球中表达量最低。三者在不同激素胁迫下呈现出不同的表达模式，CtANR2和CtANR1在不同激素处理后表达量均下降，而CtANR3在5种激素处理后表达量均有不同程度的升高。以上结果表明，红花3个CtANR基因可能在红花不同发育阶段及抵抗非生物胁迫中有不同的分工。

对东方蜜蜂微孢子虫RCDP 42基因进行分子克隆，并通过生物信息学解析RCDP 42蛋白的分子特性，进而对东方蜜蜂微孢子虫和其他物种的RCDP 42蛋白进行保守基序和结构域预测及分析。结果表明，成功克隆到东方蜜蜂微孢子虫RCDP 42基因的CDS区，RCDP 42基因在孢子中真实表达，含有540个核苷酸，可编码179个氨基酸；RCDP 42蛋白的分子质量约为20.3 ku,分子式为C_(915)H_(1416)N_(230)O_(274)S_(10),脂溶系数为86.03,等电点为6.57;包含的亲水氨基酸数量多于疏水氨基酸，但不含信号肽与跨膜结构域，说明RCDP 42可能为亲水性蛋白、胞内蛋白和非跨膜蛋白，可能包含16个磷酸化位点、63个α-螺旋、43条延长链、11个β-转角及62个无规则卷曲。在东方蜜蜂微孢子虫、蚱蜢脑炎微孢子虫和肠脑炎微孢子虫的RCDP 42蛋白中均鉴定到3个保守基序(motif 1、motif 2和motif 3)与1个结构域(Rho)。