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[期刊] 上海海洋大学学报
[作者]
蒋霞云 袁襄南 魏福卫 周培根 邹曙明
采用快速扩增cDNA末端(RACE)克隆技术,通过设计甲壳素脱乙酰酶简并引物,从总状毛霉(Mucor racemosus)菌丝体中克隆了CDA2的基因(EF468349)及其全长cDNA(DQ678929)序列。与已获得的总状毛霉菌cda1基因相比,cda2基因中不含内含子。总状毛霉cda2全长cDNA为1 378 bp,包含23 bp 5’端非翻译区、1 254 bp开放阅读框和101 bp 3’端非翻译区,编码一条由418个氨基酸残基组成的多肽链,其N端包含一段21个氨基酸残基组成的信号肽,在150～272氨基酸残基区存在一个多糖脱乙酰酶保守结构域。通过构建pET28a-cda2表达载体和...
[期刊] 林业科学研究
[作者]
刘博文 王雪庆 孙涛 亓倩 于淑惠 杨璞 陈晓鸣
白蜡虫（ＥｒｉｃＥｒｕｓ ｐＥｌａ）是我国特有的资源昆虫，泌蜡是白蜡虫二龄雄虫最为特化的性状［１］。白蜡虫分泌的白蜡在食品、医药、纺织等行业具有重要的经济价值［２］。白蜡的主要成分是２６酸２６酯［３］，已有研究表明，蜡酯的生物合成在动植物中存在保守途径［４］。蜡酯生物合成的第一步由脂酰辅酶ａ还原酶催化脂酰辅酶ａ转化为脂肪醇，第二步由蜡酯合酶（Ｗｓ）催化脂肪醇和脂肪酸的酯化反应［５］。Ｗｓ
[期刊] 渔业科学进展
[作者]
卢金凤 梁高峰 梁艳 黄倢
本研究采用RACE方法克隆了中国对虾Fenneropenaeus chinensis Rab 7基因(fcrab7)全长cDNA(GenBank:JF742050)。生物信息学分析显示,fcrab7的开放阅读框615bp,编码205个氨基酸,分子量23.2kD。FcRab7的氨基酸序列具有Rab蛋白家族的共同特征,与凡纳滨对虾和斑节对虾同源蛋白的同源性为100%。构建重组表达载体pBAD/gIIIA-fcrab7转化到大肠杆菌E.co-li进行诱导表达,诱导产物经SDS-PAGE检测和Westernblot验证。本研究结果为进一步研究WSSV与FcRab7的相互作用提供了基础。
关键词：
中国对虾 fcrab7 克隆 原核表达
[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
危蓉萍 杨东航 卜莹莹 纪燕玲 于汉寿
［目的］通过表达载体ｐ ＥＴ－２８ａ（＋）在大肠杆菌中克隆表达蜜蜂螺原体ＳｐｉｒｏｐｌａＳｍａ ｍＥｌｌｉｆＥｒｕｍ ＣＨ－１中可能与致病相关的几丁质脱乙酰酶（ＣＨｉＴｉｎ ｄＥａＣＥＴｙｌａＳＥ，Ｃｄａ）基因ＣＨｉｄ，并测定其部分酶学性质，为进一步研究该基因在蜜蜂螺原体致病过程中的作用奠定基础。［方法］利用ｏｖＥｒｌａｐ ＥｘＴＥｎＳｉｏｎ ｐＣｒ（ｏＥ－ｐＣｒ）定点突变技术，在引物设计时插入目的突变，通过３次ｐＣｒ获得突变后的目的片段，测序验证后构建重组质粒ｐ ＥＴＣＨｉｄ，挑取ＢｌＣＨｉｄ表达菌株。ｉｐＴＧ诱导表达目的蛋白，ｎＴａ－ｎｉ２＋柱纯化，ＷＥＳＴＥｒｎ ＢｌｏＴＴｉｎＧ验证，紫．．．
[期刊] 中国农业科学
[作者]
董飞 祭芳 吴季荣 殷宪超 徐剑宏 史建荣
【目的】克隆Tri101并通过原核表达获得纯化蛋白,通过免疫SPF大白兔获得高效价、高灵敏度的多克隆抗体,为Tri101蛋白及转Tri101作物的检测提供抗体基础【。方法】以禾谷镰刀菌(Fusarium graminearium)F3210为材料,PCR法获得Tri101并连接至表达载体pET29a(+),将重组表达载体转化大肠杆菌BL21(DE3)后利用IPTG进行诱导表达。利用纯化表达产物制备多克隆抗体。【结果】SDS-PAGE分析结果表明,Tri101在大肠杆菌BL21(DE3)中得到表达,重组蛋白大小为50 kD左右,以包涵体形式存在。利用HisTrap亲和柱纯化重组蛋白,最佳咪唑洗脱...
[期刊] 上海水产大学学报
[作者]
蒋霞云 周培根 李燕 王晓辉 党培育
比较了几种霉菌(毛霉、根霉、曲霉和青霉)在对数生长末期和稳定期末期的胞内和胞外甲壳素脱乙酰酶的活力。研究结果表明:(1)各霉菌的胞内和胞外都具有甲壳素脱乙酰酶活力,而且胞外酶的活力普遍大于胞内酶的活力;(2)处于对数生长期末期的毛霉菌株产甲壳素脱乙酰酶活力最高,其胞外酶活力达到了97.2±4.2 U/g干菌丝体。酶学特性研究表明:该酶的最适温度为50℃,最适pH约为7.2,低温保存稳定性较差,每24小时酶活力下降30%以上。
关键词：
甲壳素脱乙酰酶 甲壳素 壳聚糖 霉菌
[期刊] 中南林业科技大学学报
[作者]
万芳芳 刘高强 赵艳 何苑嗥 周国英
以甲壳素为唯一碳源,利用对硝基-N-乙酰苯胺为显色剂,通过变色圈法从湘江河岸边的土壤中筛选到产甲壳素脱乙酰酶的霉菌7株。其中A4菌株具有较强的产甲壳素脱乙酰酶能力。结合形态学和ITS区序列特征,A4菌株初步鉴定为串珠状赤霉菌。
关键词：
甲壳素 壳聚糖 甲壳素脱乙酰酶 菌株筛选
[期刊] 湖南农业大学学报(自然科学版)
[作者]
张伟 姬明丽 张军华 千智斌
从红鳍东方鲀（Ｔａｋｉｆｕｇｕ ｒｕｂｒｉｐｅｓ）肝脏组织中提取总ｒＮａ，通过ｒＴ–ｐＣｒ扩增，获得ｓｉｒＴ３基因的编码阅读框（Ｏｒｆ），用原核表达载体ｐ ｅＴ３２ａ（＋）构建ｐ ｅＴ３２ａ／ｓｉｒＴ３重组质粒，用异丙基–β–Ｄ–硫代半乳糖苷（ｉｐＴｇ）将重组质粒ｐ ｅＴ３２ａ／ｓＴｒＴ３在大肠杆菌ｒＯｓｅＴＴａ（Ｄｅ３）进行诱导表达，并用镍柱纯化融合表达蛋白。结果显示，红鳍东方鲀ｓｉｒＴ３基因（Ｔｒ ｓｉｒＴ３）Ｏｒｆ区大小为１ ２６３ ｂｐ大小，编码４２０个氨基酸。经ｉｐＴｇ诱导表达后，获得１个带组氨酸（Ｈｉｓ）标签的融合蛋白，目的蛋白主要存在于上清溶液中，为可溶性表达。用镍离子亲和层析柱．．．
[期刊] 华北农学报
[作者]
喻文娟 俞菊华 李红霞 李建林 唐永凯 于凡 何枫 傅纯洁
为探究脂酰辅酶A脱氢酶对脂肪酸β氧化的调控机制,使用RT-PCR在鲤鱼肝脏克隆了脂酰辅酶A脱氢酶家族中的MCAD和LCAD全长c DNA序列,阅读框分别为1 275,1 326 bp,编码424,441个氨基酸,分析表明他们均具备ACADs家族的特征序列:FAD结合位点、底物结合位点、催化位点等,与斑马鱼MCAD和LCAD的一致性分别为93.16%和94.56%。实时定量RT-PCR结果表明,MCAD和LCAD主要在肝脏和心脏表达;不同脂肪源对MCAD的表达没有明显影响,但鱼油对LCAD的表达有明显的刺激
[期刊] 中南林业科技大学学报
[作者]
王哲 谭晓风 龙洪旭
以葡萄桐的近成熟种子为材料，根据油桐转录组测序结果设计引物，采用ＲＴ－ＰＣＲ技术克隆了油桐乙酰辅酶Ａ羧化酶ＢＣ亚基基因的全长Ｃ ＤＮ Ａ序列。该基因Ｃ ＤＮＡ序列全长１ ６０５ ＢＰ，编码５３４个氨基酸。推导出的ＢＣ亚基氨基酸序列蛋白的等电点Ｐ Ｉ为７．９８，相对分子量５８ ２６２．０ ＤＡ，稳定系数为３８．１３，生物信息学分析表明，此蛋白含有２个比较明显的跨膜区，是一个不稳定的非分泌蛋白。模体搜索结果表明在ＢＣ上具有ＡＴＰ结合位点。三级结构中有１６个α螺旋，３个部分形成一个内凹的结构。
[期刊] 中南林业科技大学学报
[作者]
王哲 谭晓风 龙洪旭
以葡萄桐的近成熟种子为材料,根据油桐转录组测序结果设计引物,采用RT-PCR技术克隆了油桐乙酰辅酶A羧化酶BC亚基基因的全长c DN A序列。该基因c DNA序列全长1 605 bp,编码534个氨基酸。推导出的BC亚基氨基酸序列蛋白的等电点p I为7.98,相对分子量58 262.0 Da,稳定系数为38.13,生物信息学分析表明,此蛋白含有2个比较明显的跨膜区,是一个不稳定的非分泌蛋白。模体搜索结果表明在BC上具有ATP结合位点。三级结构中有16个α螺旋,3个部分形成一个内凹的结构。
[期刊] 林业科学
[作者]
王建勇 谭晓风 陈鸿鹏 曾艳玲 龙洪旭 梅芳芳 刘凯
【目的】油茶种仁含油率较低且易遭逆性环境等的影响,这些都严重影响和制约了油茶产业的快速发展。丙二酰单酰Co A:ACP转酰酶是脂肪酸合成酶(FASⅡ)复合体的组成酶之一,在脂肪酸合成中起着装载作用,它的酶促反应产物丙二酰单酰ACP是脂肪酸合成关键组成部分。开展该基因的功能研究,能为油茶的分子遗传育种奠定基础。【方法】以油茶品种‘华硕’种子为材料,借助其种子转录组和表达谱数据库,通过RACE技术,克隆丙二酰单酰Co A:ACP转酰酶基因并对该基因进行生物信息学分析。利用常规的酶切连接技术构建基因的原核表达载体,并利用α酮戊二酸脱氢酶(KDH)偶联系统测定表达产物的酶活性。【结果】丙二酰单酰Co ...
[期刊] 沈阳农业大学学报
[作者]
任大明 毕霏 陈红漫 阚国仕 马艳 李艳秋 于可济
绿色木霉(Trichoderma viride)所产生纤维素酶可将秸秆天然纤维素组分转化为可发酵的糖,不仅对废物进行再利用,还可以减少环境污染。以纤维素酶工业生产菌株绿色木霉Sn-9106总RNA为模板,利用RT-PCR技术反转录合成外切葡聚糖水解酶(CBHI)基因约1545bp的cDNA片段。该序列与GenBank中的cbhI E00389序列比较,氨基酸序列同源性达91%。大肠杆菌BL21原核表达和SDS-PAGE结果表明,重组蛋白分子量约为53kDa,重组酶活力为5.3U.mg-1。
[期刊] 中国农业科学
[作者]
周晓卉 黄丽华 蒋向 李育强 张学文
【目的】揭示棉田杂草薤白(Allium macrostemon Bunge)抗草甘膦的分子机理,开发利用其草甘膦抗性特性。【方法】运用RT-PCR结合RACE技术,分离克隆了薤白中草甘膦作用的靶酶EPSP合成酶(EPSPs)基因cDNA,并将其构建成原核表达载体在大肠杆菌中诱导表达和鉴定其抗性。【结果】薤白EPSP合成酶基因cDNA序列全长1821bp,编码一段522个氨基酸的推导蛋白质。经BLAST及蛋白质结构预测,蛋白具有EPSPs的特征序列,并与已报道的EPSPs序列有高同源性,确认克隆的cDNA序列即是薤白EPSPs基因序列,命名为EPSPsA。将该cDNA与原核表达载体pRSET-A...
[期刊] 沈阳农业大学学报
[作者]
付洪冰 崔莹 崔崇士
从贝达葡萄中提取总RNA,采用RT-PCR方法,克隆到了白藜芦醇合酶(resveratrol synthase,RS)基因的全长cDNA。将其与圆叶葡萄(Vitis rotundifolia)、华东葡萄(Vitis pseudoreticulata)、河南毛葡萄(Vitis ficifolia)、河岸葡萄(Vitis vulpine)、酿酒葡萄(Vitis virufera)、羊蹄甲(Bauhinia)、花生(Arachis hvpogaea)、虎杖(Polygonum cuspiaatum)、大黄(Rheum officinale)进行氨基酸同源性比对,结果表明:分离的RS基因与其他葡萄的R...
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