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[期刊] 淡水渔业
[作者]
李常健 蒋琼凤
采用SDS-PAGE分离纯化彩鲫(Carassius auratus gibelio)ran基因编码区cDNA全长序列的原核表达蛋白,并以此为抗原免疫家兔,制备了相应的多克隆抗体;W estern b lotting结果表明,该抗体效价为1∶1000,具有较高的特异性。并从抗原蛋白相对分子质量、每次注射蛋白量、注射方式、注射途径等诸方面对该技术的要点进行了介绍。
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
马跃 王建珏 黄江涛 张天颖 史怀平
【目的】原核表达奶山羊表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)蛋白胞外区25-644位共620个氨基酸序列(ECD序列),纯化蛋白并免疫家兔,制备针对山羊EGFR蛋白的特异性多克隆抗体,为山羊EGFR蛋白功能研究奠定基础。【方法】以pMD19-T-EGFR为模板,采用PCR方法扩增得到EGFR胞外区(ECD)基因序列。将ECD序列连接pET-32a(+)质粒构建pET-32a(+)-ECD原核表达载体,将该重组载体导入大肠杆菌BL21(DE3)中并诱导
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
陈春琳 刘祥 俱雄
【目的】构建溶藻弧菌外膜蛋白OmpK原核表达载体,优化OmpK蛋白的诱导表达条件,制备OmpK蛋白小鼠多克隆抗体。【方法】通过PCR扩增获得ompK基因,连接pET-32a质粒构建OmpK-pET32a载体,将其转化大肠杆菌BL21后进行诱导表达。利用切胶纯化获得OmpK蛋白后,免疫小鼠制备OmpK蛋白多克隆抗体,采用ELISA法检测抗体效价,Western-Blotting法检测抗血清特异性。通过正交试验,获得OmpK菌株的最佳诱导表达条件与培养条件。【结果】PCR扩增获得了长816bp的ompK基因;成功构建了OmpK-pET32a载体,其诱导表达产物分子质量为30ku,与预期结果一致。E...
[期刊] 福建农林大学学报(自然科学版)
[作者]
陈媛 屈贵蜀 彭尧舜 许丽惠 王全溪
根据FAdV-4 NP株F1蛋白编码框的主要抗原位点,设计一对特异性引物,经PCR扩增、测序,分析表达效率后,进行密码子优化;以合成的新序列作为模板,构建重组表达质粒pET-32a-F1,将质粒转化到BL21中,筛选诱导条件,Western blot鉴定表达产物;将待纯化蛋白依次经过不同浓度的咪唑洗脱,纯化重组蛋白;最后将纯化后的蛋白免疫新西兰黄兔,收集血清并用间接ELISA法测定抗体效价.结果表明,所设计的特异性引物扩增了一条约699 bp的片段.PCR验证和酶切鉴定表明,pET-32a-F1被成功构建,并能够高效表达.重组质粒pET-32a-F1诱导的最佳IPTG浓度为0.3 mmol·L~(-1),最佳诱导时间为5 h,最佳诱导温度为37℃;咪唑洗脱浓度为80 mmol·L~(-1)时,能获得较单一的洗脱蛋白.此外,本试验制备的F1多克隆抗体的效价可达1∶1 024 000.
[期刊] 华北农学报
[作者]
刘祥
为构建小鼠BMP3蛋白原核表达载体,纯化BMP3蛋白,制备并鉴定BMP3蛋白小鼠多克隆抗体,以及对BMP3进行系统进化关系研究。采用RT-PCR方法从小鼠肝脏中克隆获得BMP3蛋白的表达菌株;利用SDS-PAGE电泳切胶纯化、尿素梯度复性获得BMP3蛋白,免疫小鼠制备BMP3蛋白多克隆抗体;采用ELISA法检测抗体滴度达1∶3 200倍,Western Blotting证实抗血清具有很好的特异性。通过DNAMAN软件对BMP3序列同源性分析发现其C-端在不同动物间存在较高同源性;MEGA软件对BMP3序列的系统发生分析证实BMP3在动物间具有明显的进化趋势。为BMP3蛋白调控骨代谢及与肿瘤的关...
[期刊] 华中农业大学学报
[作者]
张艳维 张永安 涂加钢
为研究L蛋白在乌鳢水泡病毒(snakehead vesiculovirus, SHVV)增殖过程中发挥的作用,扩增SHVV L基因的前900个碱基,将其克隆到载体pET-32a(+)中,构建原核表达质粒pET32a-L,并转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞。设置不同温度、IPTG浓度及诱导时间,选择最佳的表达条件。通过NI-NTA亲和层析柱纯化蛋白,并利用纯化的蛋白免疫新西兰大白兔,制备多克隆抗体。用Western blot鉴定抗体特异性,间接免疫荧光观察L蛋白在SHVV感染斑点叉尾鮰卵巢细胞(channel catfish ovary, CCO)中的定位情况。结果显示,纯化的L蛋白分子质量约42 ku,与预期大小相符。制备的L蛋白多克隆抗体可以与L蛋白发生特异性免疫反应,且L蛋白主要定位在细胞质,表明L蛋白多克隆抗体制备成功。
[期刊] 中国农业科学
[作者]
徐秋芳 陈晴晴 倪海平 李硕 张金凤 周益军
【目的】通过筛选灰飞虱cDNA酵母表达文库发现原肌球蛋白(tropomyosin,Tm)能与水稻黑条矮缩病毒(Rice black-streaked dwarf virus,RBSDV)P10蛋白发生互作。研究旨在克隆灰飞虱原肌球蛋白基因(Tm),将其在原核细胞中进行表达,纯化Tm蛋白,免疫大白兔并制备其多克隆抗体,为进一步分析Tm在灰飞虱与RBSDV互作过程中的作用提供抗体条件。【方法】根据与之高度同源的Tm基因信息确定灰飞虱Tm的开放阅读框(open reading frame,ORF)。提取灰飞虱总RNA,采用RT-PCR方法从灰飞虱中克隆Tm的ORF,连接至pMD-18T载体后进行测序...
[期刊] 中国水产科学
[作者]
孙盛明 戈贤平 傅洪拓 朱健 张世勇 乔慧
应用RACE技术克隆了青虾(Macrobrachium nipponense)的Hc基因全长cDNA序列,并对该基因序列特征进行了分析。青虾Hc基因cDNA全长2 235 bp,包括10 bp的5′末端非翻译区(UTR),2 074 bp的开放阅读框(ORF),151 bp的3′UTR,开放阅读框编码688个氨基酸。蛋白相似度比对显示,青虾血蓝蛋白含有典型的6个保守的铜离子结合位点。系统进化树分析表明,青虾Hc与脊尾白虾(Exopalaemon carinicauda)Hc聚在一起,具有最近的亲缘关系。荧光定量PCR检测显示,Hc基因在青虾不同组织中均有表达,其表达量在肝胰腺中最高;使用荧光定...
[期刊] 福建农林大学学报(自然科学版)
[作者]
杨振慧 葛均青 刘荭 杨金先 郑晓聪 林天龙
根据鲤春病毒血症病毒(SVCV)基因组序列(GenBank:NC_002803),人工合成M基因开放阅读框序列,克隆至原核表达载体pET-32a(+),转化工程菌株BL21(DE3),在0.1 mmol.L-1 IPTG、37℃下诱导5 h,获得高效表达的M蛋白,但其主要以包涵体的形式存在,经超声破碎、包涵体纯化后,再经Ni亲和层析柱纯化,获得高纯度的M蛋白.以纯化的M蛋白为抗原免疫新西兰大白兔,制备了M蛋白的多克隆抗血清.ELISA检测显示抗血清的效价达1∶128000;western blot分析显示抗血清能够识别SVCV的M蛋白,表明其具有较好的灵敏性和特异性.
[期刊] 淡水渔业
[作者]
王艺舟 潘启华 王乾 夏必琳 罗君志 方健 邓羽 廖明聪 陈天圣
实验进行了青鱼(Mylopharyngodon piceus)Dazl基因的原核表达,兔抗青鱼源Dazl多克隆抗体的制备及抗体的特异性验证。首先将青鱼Dazl基因的编码区利用重组表达引物从pCS2-MpDazl质粒中扩增出来,经酶切后连接到pET-28a载体中,构建pET-28a-MpDazl重组表达载体。然后将pET-28a-MpDazl重组质粒转化至大肠杆菌(Escherichia coli)BL21中,利用异丙基-β-d-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,获得分子量为27 kD的Dazl重组蛋白。将纯化的Dazl重组蛋白作为抗原免疫家兔制备多克隆抗体,抗体的效价和特异性通过ELISA法和Western blot检测。结果:成功构建重组表达载体pET-28a-MpDazl;以0.5 mmol/L IPTG在37℃条件下诱导4 h可获得高效表达的Dazl重组蛋白;制备的兔抗青鱼Dazl多克隆抗体能够特异性识别原核表达Dazl蛋白、青鱼卵巢的内源Dazl蛋白以及细胞中过表达的Dazl蛋白,并证实了青鱼Dazl蛋白在性腺中表达的特异性。
[期刊] 水产学报
[作者]
丁炜东 曹哲明 曹丽萍
抗苗勒氏管激素(anti-mullerian hormone,AMH),也称苗勒氏管抑制物质(mullerianin hibiting substance,MIS),为肽类生长因子,属于TGF-β生长和分化因子家族。为研究AMH对奥利亚罗非鱼性腺发育的作用,应用DNAstar软件分析罗非鱼AMH基因的抗原性,选择抗原性较强的22～243氨基酸作为目的片段构建了AMH的原核表达载体并进行融合表达。首先利用RT-PCR方法从性腺中扩增出长约663bp的目的序列AMH基因,克隆至T载体中,经酶切鉴定和序列测定分析确认序列的正确性后将此片段克隆到表达载体pGEX-5x-1中构建重组表达质粒pGEX-A...
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
王玥 梁爽 梁慧珂 郁飞 齐亚飞
【目的】将拟南芥叶绿体发育必需蛋白ＰＡＣ进行大肠杆菌原核表达和纯化，并免疫家兔，获得针对ＰＡＣ蛋白的多克隆特异性抗体，为进一步研究ＰＡＣ蛋白在叶绿体发育中的功能提供保证。【方法】将编码拟南芥ＰＡＣ蛋白的ＣＤＮＡ克隆至原核表达载体ＰＥＴ－２８Ａ中，转化ＢＬ２１（ＤＥ３）表达菌，经ＩＰＴＧ诱导后，对诱导产生的ＰＡＣ蛋白进行镍柱亲和纯化和ＳＤＳ－ＰＡＧＥ割胶纯化，并将纯化的ＰＡＣ蛋白通过皮下注射免疫家兔，利用分离得到的抗血清，针对拟南芥野生型、ＰＡＣ敲除突变系ＰＡＣ－１和ＰＡＣ过表达系ＰＡＣＯＥ的总蛋白进行免疫印迹检测。【结果】成功构建了拟南芥基因ＰＡＣ的原核表达载体ＰＥＴ－２８Ａ－ＰＡＣ，在３７℃．．．
关键词：
叶绿体 PAC蛋白 原核表达 抗体制备
[期刊] 海洋渔业
[作者]
刘晓玲 王振东 孙涵甜 王振华 赵振军 李忌
以栉孔扇贝(Chlamys farreri)卵巢cDNA为模板,采用PCR扩增Foxl2(forkhead box l2)基因,通过双酶切与pET-28a构建重组质粒表达载体,转化大肠杆菌感受态细胞DH5α,筛选鉴定阳性克隆,经测序鉴定后提取质粒转化大肠杆菌感受态细胞BL21,以IPTG诱导Foxl2蛋白表达,用SDS-PAGE鉴定表达情况,经镍柱纯化表达蛋白,通过免疫新西兰白兔(New Zealand white rabbits)制备多克隆抗体,以ELISA测定抗体效价,最后用WB(Western Blot)检测抗体特异性。结果表明,重组载体转化BL21后经1.0 mmol L~(-1)IPTG于37℃诱导6 h可产生大量Foxl2蛋白,主要以包涵体形式表达。经镍柱柱纯化可得到纯度较高的Foxl2蛋白,浓度达800 ug·mL~(-1)。免疫新西兰白兔获得多克隆抗体,效价大于1∶128 000。WB检测显示:该抗体能特异识别扇贝卵巢中的Foxl2蛋白,同时发现Foxl2蛋白在卵巢中强表达,而在精巢中几乎不表达,揭示栉孔扇贝中该蛋白具雌性性别相关性。研究成功获得效价高且能特异识别天然Foxl2的多克隆抗体,为后续深入研究Foxl2在栉孔扇贝卵巢中的功能提供了分子工具。
[期刊] 西南农业学报
[作者]
廖健淇 谢芝勋 张民秀 张艳芳 罗思思 李孟 谢志勤 谢丽基 邓显文 范晴 曾婷婷 黄娇玲 王盛
【目的】原核表达鸡细小病毒（ChPV）的NS1和VP2蛋白，制备其多克隆抗体，为深入探究ChPV蛋白结构功能及建立血清学诊断方法提供物质基础。【方法】通过合成ChPV GX-Ch-PV-21毒株的NS1和VP2蛋白基因序列，构建原核重组表达载体pET-32a-NS1和pET-32a-VP2，将测序正确的重组质粒转化至大肠杆菌transsetta感受态细胞进行原核表达，优化表达条件，以十二烷基硫酸钠—聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE）电泳和免疫印迹（Western-blotting）方法鉴定NS1和VP2蛋白的表达情况。将表达产物免疫无特定病原体（SPF）鸡获得多克隆抗体，采用酶联免疫吸附实验(ELISA)方法测定其效价，以Western-blotting和间接免疫荧光试验(IFA)对多克隆抗体进行鉴定。【结果】SDS-PAGE分析结果显示，NS1和VP2蛋白条带大小分别约为104.0和87.0 kD，与预期条带大小相符。对重组质粒pET-32a-VP2和pET-32a-NS1进行最佳诱导条件筛选，结果显示NS1蛋白表达的最佳诱导条件为异丙基-beta-D-硫代半乳糖吡喃糖苷（IPTG）终浓度1.0 mmol/mL，16 ℃诱导表达过夜；VP2蛋白表达的最佳诱导条件为IPTG终浓度0.8 mmol/mL，20 ℃诱导表达过夜。可溶性分析结果显示，NS1和VP2蛋白主要以包涵体形式存在；间接ELISA检测NS1和VP2蛋白的多克隆抗体效价均为1︰10240000；Western-blotting鉴定结果表明，His标签蛋白和相对应的鸡多克隆抗体均能与NS1和VP2蛋白特异性结合；IFA分析结果显示，VP2和NS1蛋白多克隆抗体均能与ChPV特异性结合。【结论】成功表达ChPV的NS1和VP2蛋白和制备的鸡多克隆抗体，可作为深入探究ChPV蛋白结构功能及建立ChPV血清学诊断方法的基础材料。
[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
王娟 王桂萍 张红生 夏妍 沈振国
为研究耐铜植物海州香薷的金属硫蛋白(EhMT1)的结构与功能,运用分子生物学方法构建了pGEX-2T-EhMT1重组表达载体,经转化大肠杆菌BL21(DE3)后表达得到大小为33×103左右的融合蛋白GST-EhMT1,与预期结果一致。对融合蛋白诱导表达的温度、时间、IPTG诱导浓度等条件进行了优化,成功构建了能大量表达可溶性GST-EhMT1的优良原核表达体系。诱导表达的融合蛋白经GST-Sepharose亲和层析纯化后,每升菌液获得的可溶性融合蛋白高达70mg。用纯化的融合蛋白免疫新西兰雄兔,制备的抗血清经间接ELISA检测到较高的多克隆抗体效价。蛋白质印迹结果显示,纯化的蛋白质与兔抗血清...
关键词：
金属硫蛋白 原核表达 融合蛋白 抗血清
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