根据弧菌属细菌(Vibrio spp.)共有的rpo A基因序列,比对和设计了一对PCR引物,建立了能够快速而准确地检测弧菌属细菌的通用PCR检测方法,该方法对靶标DNA的检测灵敏度为58 fg/μL,对菌液的检测灵敏度为2.7×102cfu/m L,能够区分该属细菌与其它属的细菌,具有极高的特异性。使用建立的方法对分离自南美白对虾的病原菌进行了检验,并结合16S r DNA序列分析,结果显示待检测病原均为弧菌属的细菌,与测序结果一致,说明该检测方法可用于弧菌属细菌的检测和诊断。

以副溶血弧菌毒素调控基因(toxin regulations,toxR)作为靶标基因,设计特异性引物及TaqMan探针,以含toxR基因的质粒为模板,建立质粒拷贝数与CT值的标准曲线,分别采用含toxR基因质粒、纯培养的副溶血弧菌和添加副溶血弧菌的牡蛎(Ostrea)模拟样品进行灵敏度试验,结果表明,其灵敏度分别为15拷贝、18 CFU/mL和180 CFU/mL。同一个样品的30次重复性试验表明,试验内及试验间的变异系数分别为0.95%和1.5%。结果显示,本研究建立的副溶血弧菌荧光定量PCR检测方法特异性强、灵敏度高、重复性好,可用于牡蛎等水产品中副溶血弧菌的定量检测。

本研究检测了分离自发病大菱鲆、半滑舌鳎及鲤鱼的22株病原鳗弧菌(Vibrio anguillarum)毒力相关基因的携带情况,并建立了病原鳗弧菌的分子生物学检测方法。以PCR方法检测8个毒力相关基因的分布,结果显示,22株病原鳗弧菌均可扩增出6个基因(emp A、vah1、vah4、fla A、rtx A和ton B)目的条带,未扩增出vir A和ang M基因;针对vah4和rtx A设计引物进行双重PCR扩增,同一PCR反应体系可扩增出两条目的条带,灵敏度为2.4×103 CFU/ml,对照菌无任何扩增条带;以vah4设计引物进行LAMP扩增,病原鳗弧菌可扩增出阶梯状条带,呈现阳性反应,6...

本研究检测了分离自发病大菱鲆、半滑舌鳎及鲤鱼的２２株病原鳗弧菌（Ｖｉｂｒｉｏ ａｎｇｕｉｌｌａｒｕｍ）毒力相关基因的携带情况，并建立了病原鳗弧菌的分子生物学检测方法。以ＰＣｒ方法检测８个毒力相关基因的分布，结果显示，２２株病原鳗弧菌均可扩增出６个基因（ｅｍＰａ、Ｖａｈ１、Ｖａｈ４、ｆｌａａ、ｒｔｘａ和ｔｏｎｂ）目的条带，未扩增出Ｖｉｒａ和ａｎｇｍ基因；针对Ｖａｈ４和ｒｔｘａ设计引物进行双重ＰＣｒ扩增，同一ＰＣｒ反应体系可扩增出两条目的条带，灵敏度为２．４×１０３ Ｃｆｕ／ｍｌ，对照菌无任何扩增条带；以Ｖａｈ４设计引物进行ｌａｍＰ扩增，病原鳗弧菌可扩增出阶梯状条带，呈现阳性反应，６株对照菌无阶梯．．．

研究基于哈氏弧菌HSP60基因序列设计1对特异性引物,通过优化PCR条件,特异性及敏感性检测,建立了一套哈氏弧菌特异性PCR检测方法。结果表明,该PCR检测方法可使分离自患病南美白对虾的哈氏弧菌扩增出238 bp的HSP60基因片段,其他五种对照病原弧菌未扩增出任何条带;检测方法最低能检测出2.1 pg的哈氏弧菌基因组DNA。表明建立的哈氏弧菌PCR检测方法可用于该菌引起的水产动物疾病的快速诊断。

哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)是引起海南省后水湾深水网箱养殖卵形鲳鲹(Trachinotus ovatus)"烂身病"的主要病原菌。为了能够快速诊断该病原菌,急需建立一种耗时短、准确以及便捷的检测方法。本研究利用分离到的致病菌株QT520的ToxR基因序列设计特异性引物和加入SYTO-9特异荧光染料,建立了一种可以实时、快速检测哈维氏弧菌的LAMP法(RT-LAMP)。该方法对哈维氏弧菌的基因组DNA及菌液灵敏度分别为100 fg/μL和10~3 cfu/mL,与Real-time PCR法检测灵敏度相当,比普通PCR的检测灵敏度要分别高1000倍和10倍,能有效区分哈维氏弧菌与坎氏弧菌(Vibrio campbellii);可以实时观察检测结果,且检测时间只需要40 min;具有耗时短、特异性和灵敏度高、仪器便携、操作简单且能实时观察检测结果等优点,非常适合在生产现场进行哈维氏弧菌的检测。

基于霍乱弧菌lolB基因保守序列设计1对特异性引物,建立了SYBR GreenⅠ实时定量PCR检测霍乱弧菌的方法。常规PCR检测仅霍乱弧菌扩增出大小为519bp的目的片段,其他3种病原弧菌均为阴性;SYBR GreenⅠ实时定量PCR,在Tm为86.5～87℃,扩增产物的熔解曲线只出现1个单特异峰,无引物二聚体,表明该引物具有较好的特异性。SYBR GreenⅠ实时定量PCR扩增曲线反映了PCR的指数增长阶段和平台阶段;所制作的标准曲线在2.59×108～2.59×100拷贝数之间有较好的线性关系,相关系数为0.993,能对霍乱弧菌进行准确的定量分析。该方法检测时间从核酸抽提到结果分析仅需4～...

通过检索、多重比对、分析和筛选GenBank中对虾白斑综合征病毒(WSSV)、传染性皮下和造血器官坏死病毒(IHHNV)、副溶血弧菌、创伤弧菌、哈维氏弧菌和溶藻胶弧菌的基因序列,设计了10对特异性引物,以已知毒株和菌株的DNA为模板进行PCR,均能扩增出与实验设计相符合的DNA片段,对PCR扩增条件进行优化,建立了可同时检测鉴别WSSV、IHHNV、副溶血弧菌、创伤弧菌、哈维氏弧菌和溶藻胶弧菌,并且能同时区分WSSV不同地理毒株的同步PCR方法。研究结果表明,该方法检测特异性好,检测通量大,适合于对虾多种病原的同时检测。

为了建立一种能同时检测１类整合子、４类超级整合子和１型插入序列共同区的多重ＰＣＲ检测方法，根据Ｇｅｎ Ｂａｎｋ中１类整合子整合酶基因ｉｎｔ１、４类超级整合子整合酶基因ｉｎｔＳＸｔ和１型插入序列共同区转座酶基因ｉＳＣＲ１的序列，应用ＰＲｉｍｅＲ ＰｌｅＸ ２．６１设计３对特异性引物，通过改变引物浓度和退火温度对多重ＰＣＲ体系进行了优化。此后，评价了所建立多重ＰＣＲ体系的特异性和灵敏度，并应用于２２２株海水养殖源弧菌中３种整合子相关元件的检测。结果显示，设计的３对引物能分别单独且特异性地扩增出５６９ ＢＰ、４３０ ＢＰ和６５１ ＢＰ的目的条带；当ｉｎｔ１、ｉｎｔＳＸｔ和ｉＳＣＲ１３对引物（１０ Ｐ．．．

溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)、副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)和哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)是浙江省养殖大黄鱼(Pseudnosciaena crocea)弧菌病的主要致病菌。本研究选择针对溶藻弧菌和副溶血弧菌的胶原酶基因,哈维氏弧菌的部分ToxR基因的特异性,优化设计了3对特异性引物,通过进行多重PCR反应体系优化,多重PCR产物的测序鉴定与特异性和敏感性实验,建立了一种检测致病性弧菌的多重PCR检测方法。经过琼脂糖凝胶电泳后的条带分析判断,可以在一个PCR管中同时成功地检测这3种病原细菌,含溶藻弧菌、哈维氏弧菌和副溶血弧菌3...

建立扩增内标存在下同时检测副溶血弧菌tlh基因和trh基因的多重PCR方法。以细菌16SrDNA片段为扩增内标对照(internal amplification control,IAC),副溶血弧菌不耐热溶血毒素(thermolabile hemolysin,TLH)基因tlh和相对耐热直接溶血毒素(thermostable related hemolysin,TRH)基因trh为检测基因,设计引物,并优化多重PCR体系。特异性及灵敏度试验结果表明:该多重PCR体系检测致病性副溶血弧菌表现出极好的特异性。纯培养条件下,扩增内标存在时tlh基因和致病基因trh的检测灵敏度分别为1.3×102 c...

腐皮综合征是近年来刺参养殖最主要的疾病,导致刺参大批死亡和惨重的经济损失。根据其主要致病原灿烂弧菌(Vibrio splendidus)的16S~23S间隔区序列,设计特异性引物,利用PCR技术,从纯化的V.splendidus DNA中成功地扩增出产物大小为177bp的DNA片断,并对此方法的灵敏度和特异性进行了研究。结果表明,PCR技术对V.splendidus DNA的检测灵敏度为0.5pg,并且对灿烂弧菌的DNA呈现特异性,而与其他细菌V.fluvialis、V.anguillarum、V.alginolyticus、Aeromonas hydrophila、V.harveyi、V.p...

为了建立一种快速检测镰孢菌属的方法。根据Fusarium翻译延伸因子(TEF-1α)基因序列,设计并筛选其特异性引物F8-1/F8-2,能从靶标基因组DNA中特异性扩增出大小为187 bp的目的片段,建立Fusarium荧光定量PCR(RT-PCR)检测体系的灵敏度比常规PCR高104倍,且特异性良好。利用该反应体系检测不同湿度环境下病残体和土壤病残体DNA含量的动态变化。结果表明:病残体及土壤病残体DNA初始拷贝数分别为6. 90×10~(11),1. 06×10~(12)拷贝数/g,经过温度27℃、80%湿度下处理30 d病残体DNA含量下降至5. 55×10~8和0拷贝数/g,而在温度27℃、20%湿度下含量分别为8. 04×10~9,1. 30×10~9拷贝数/g。因此,建立的Fusarium实时荧光定量PCR检测体系具有特异性强、灵敏度高的特点,可以快速准确地定量检测病残体DNA的含量,为瓜类根腐病的早期预防和流行监测提供了有效的技术手段。

选取杀鲑气单胞菌A层A蛋白(VapA)保守序列,利用Primer Express 2.0软件设计引物和探针。以ATCC标准株10倍系列稀释,通过血球计数板计数后进行实时定量PCR,制作标准曲线。通过SDS软件获得细菌数量(X)与Ct值的关系为:Ct=-3.1574lgX+43.6841(相关系数R2=0.992)。实时定量PCR的检测限为6个细菌。建立的方法对杀鲑气单胞菌典型株和非典型株具有较好的特异性,与其他细菌没有交叉反应。杀鲑气单胞菌实时定量PCR方法的建立,对于快速口岸检疫、临床诊断和疫病监测具有重要的应用价值。

【目的】大豆根瘤菌（Bradyrhizobium japonicum）是微生物肥料重要的功能菌种之一，可通过生物固氮为大豆生长提供氮素，实现节本增效，菌株5873作为其典型代表，已广泛应用于农业生产。筛选并鉴定其特异引物，建立大豆根瘤菌5873菌株水平的快速检测方法，对微生物肥料生产菌种鉴定、产品质量检测和功能评价至关重要。【方法】以商业化菌株大豆根瘤菌5873为供试材料，基于其全基因组序列和NCBI数据库中大豆根瘤菌种内参比菌株相关序列，以及与其高度同源（基因组ANI值大于99.95%）的大豆根瘤菌USDA 6T差异片段，通过多重序列比对，进行特异引物设计和筛选，获得特异性引物对，并通过对PCR反应条件/体系优化、特异性及灵敏度检测，建立大豆根瘤菌5873的快速检测方法。然后，采用盆栽试验，将大豆根瘤菌5873与其他根瘤菌菌株混合接种于大豆根际，应用上述方法对大豆根瘤菌5873竞争结瘤能力进行评价和方法验证。【结果】筛选获得了一组特异引物4-4和Q1(4-4-F 5′-GATAAGGCCACGGGTGAACA-3′/4-4-R 5′-CACTCGATAAGCTCCGCTGT-3′和Q1-F 5′-CCGGTCGTGACTGGAATGAT-3′/Q1-R 5′-TCGAGGCCTACAAGAACGTC-3′)，优化并建立了PCR快速检测方法，即反应体系：Premix Taq~(TM) 12.5μL，引物各1.0μL，基因组DNA 15 ng左右，加ddH2O补足至25μL；反应条件：95℃预热5 min,94℃变性45 s,61℃退火45 s,72℃延伸60 s,30个循环，再72℃延伸10 min。通过凝胶电泳检测目的条带的有无（355和218 bp），即可实现大豆根瘤菌5873的快速检测，该方法检出灵敏度为1 850 CFU/μL。此外，借助该方法可以成功地评价大豆根瘤菌5873竞争结瘤能力，与传统BOX-PCR评价结果一致。【结论】大豆根瘤菌5873快速鉴定方法的建立实现了以菌体发酵液或根瘤破碎提取液为模板，直接进行PCR扩增的鉴定操作，省去了根瘤的分离、根瘤菌分离纯化、培养、DNA提取及测序鉴定等繁琐的环节，大大减少了工作量，只需短短几个小时便可准确检测大豆根瘤菌5873，为微生物肥料中根瘤菌菌剂的产品质量检测和竞争结瘤能力评价提供了参考。