将杂色鲍(Haliotisdiversicolor)注射感染大肠杆菌(E.coli)和副溶血弧菌(Vibrioparahemolyticus),在感染后第4、8、12、24、48、96、192小时分别采集无细胞血淋巴,测定碱性磷酸酶(ALP)、酸性磷酸酶(ACP)和超氧化物岐化酶(SOD)的活力。结果表明,弧菌组ACP的活力在第24小时比对照组显著增高;弧菌组的ALP与对照组相比,在第8小时显著增高,第48小时极显著升高,第96小时显著下降。弧菌组的SOD活力在24小时与对照组相比显著降低。而大肠杆菌组ALP、ACP和SOD的活力跟对照组相比,各个时相均无显著差异。由此可见,杂色鲍对致病菌和非...

将 1 2种中草药按其不同的药理作用和药效进行配伍 ,形成 5组复方中草药 ,分别编号为中草药 1～ 5号。将以上中草药添加到杂色鲍幼鲍的人工配合饲料中 ,连续喂饲幼鲍 ,饲养 4 7d后 ,测定幼鲍无细胞血淋巴中超氧化物歧化酶 (SOD)、酸性磷酸酶 (ACP)、碱性磷酸酶 (AKP)、溶菌酶(LSZ)活力。结果显示 ,所有添加中草药的SOD活力均比对照组降低 ,中草药 1、5号可提高幼鲍血淋巴的ACP和LSZ活力 ,而对AKP则起到降低的作用 ;中草药 3、4号可提高幼鲍血淋巴的LSZ活力 ,却降低幼鲍血淋巴的ACP和AKP活力 ,中草药 2号对ACP、AKP和LSZ活力均有提高作用 ,具...

采用RDP试剂提取杂色鲍(Haliotisdiversicolor)不同免疫时相肝脏的总RNA,经Oligotex试剂盒纯化得到mR NA。根据SMART(switchingmechanismat5′endofRNAtranscript)原理,利用含sfiIB酶切位点的Oligo(dT)引物合成cDNA第1条链,利用含sfiIA酶切位点的SMARTⅢ寡核苷酸作为cDNA第1条链在mRNA5′端延伸出去的模板,采用LD-PCR引物合成双链cDNA。双链cDNA用sfiI酶切和过柱分级分离后,与λTripEx2两臂进行连接,随后进行λ噬菌体体外包装反应,构建成杂色鲍不同免疫时相(12h和24h)全...

通过检测注入斑节对虾(Penaeus monodon)血淋巴内的鳗弧菌(Vibrio anguillarumH)浓度、血淋巴细胞浓度和血淋巴细胞的组成变化,研究斑节对虾血淋巴细胞对进入体内细菌的清除作用。实验显示,斑节对虾能够迅速清除注入其体内的鳗弧菌。注射鳗弧菌悬液(107~108CFU/mL)5 min后,血淋巴中可检测到的鳗弧菌浓度是(1.4±0.6)×106CFU/mL,而2 h后所检测到的鳗弧菌的浓度仅相当于前者的3.1%。7天后,仅在部分个体的血淋巴中检测到少量鳗弧菌。伴随着血淋巴液内鳗弧菌的减少,对虾的血淋巴细胞浓度发生变化。鳗弧菌注入对虾体内5 min后,血淋巴细胞浓度为(3....

为研究绵羊大肠杆菌性乳腺炎中乳腺成纤维细胞的损伤情况及TLR4的作用机制，通过体外培养获得原代绵羊乳腺成纤维细胞，大肠杆菌人工感染细胞建立大肠杆菌性乳腺炎细胞模型，分析大肠杆菌对细胞损伤的影响及TLR4在大肠杆菌性乳腺炎中的作用。采用酶消化法结合差速消化法获得原代绵羊乳腺成纤维细胞；MTT法检测细胞活力及TLR4阻断剂CLI-095的细胞毒性作用；乳酸脱氢酶法检测大肠杆菌对绵羊乳腺成纤维细胞的损伤情况并筛选最适MOI比值；qRT-PCR法检测caspase-3、TLR4的mRNA相对表达量及CLI-095的阻断效果；比色法检测细胞焦亡蛋白caspase-4,5的酶活性；WB检测TLR4蛋白的相对表达量；平板活菌计数法检测CLI-095对大肠杆菌黏附绵羊乳腺成纤维细胞的影响。分离获得绵羊乳腺成纤维细胞，MTT测定结果显示，细胞活力良好；大肠杆菌以最适MOI=4∶1感染绵羊乳腺成纤维细胞后，各时间段LDH释放量均显著升高；caspase-3 mRNA的相对表达量在感染1～3 h内显著上升，3 h后表达量显著下降；caspase-4,5酶活性在感染1～3 h内升高，3 h后降低。TLR4的mRNA及蛋白表达量均显著上调，CLI-095可抑制大肠杆菌对细胞的黏附作用。大肠杆菌感染成纤维细胞后LDH释放量增加、caspase-3基因表达上调、caspase-4,5酶活性升高，促进了绵羊乳腺成纤维细胞的损伤、凋亡及焦亡；大肠杆菌感染促进绵羊乳腺成纤维细胞内TLR4 mRNA及蛋白的表达；TLR4阻断剂CLI-095可能通过抑制TLR4的表达抑制E.coli对细胞的黏附作用。

研究了保存时间、温度和抗冻剂对大肠杆菌感受态细胞保存的影响。结果表明:在4℃-、40℃、-70℃条件下,大肠杆菌感受态细胞转化效率在保存前期随保存时间增加呈上升趋势,转化效率在第1天或第7天达到最大值,此后随保存时间增加而呈下降趋势;在保存前期,保存于4℃的大肠杆菌感受态细胞转化效率高于保存在-70℃、-40℃的大肠杆菌感受态细胞的转化效率,在保存后期低于保存在-70℃、-40℃的大肠杆菌感受态细胞的转化效率;在相同保存温度和保存时间下,保存在甘油的大肠杆菌感受态细胞转化效率高于保存在DMSO的大肠杆菌感受态细胞的转化效率。

【目的】对超高压作用后大肠杆菌细胞膜的荧光偏振度和微黏度的影响进行研究,探讨超高压对大肠杆菌细胞膜流动性的影响。【方法】以1,6-二苯基-1,3,5,-己三烯(DPH)为荧光探针标记大肠杆菌细胞膜,用荧光偏技术测定大肠杆菌细胞膜经超高压作用后荧光偏振度和微黏度的变化。【结果】建立了用DPH标记和荧光偏振法测定大肠杆菌细胞膜流动性条件;不同的处理压力和时间对大肠杆菌细胞膜的荧光偏振度和微黏度的影响不同,350～400MPa作用15～40min,细胞膜荧光偏振度及微黏度达到稳定水平,350MPa作用15min已经使细胞膜流动性显著降低(P<0.05)。【结论】随着压力的增大和保压时间的延长,大肠杆...

【目的】以大肠杆菌ATCC43889为试材,研究热胁迫处理对其细胞膜和膜蛋白的影响,为高温杀菌技术在食品工业中的应用奠定理论基础。【方法】研究ATCC43889分别经50℃、60℃和70℃热胁迫处理15 min并转接10次培养后,获得的3种抗热性ATCC43889菌株的细胞膜和膜蛋白变化。采用扫描电子显微镜分别观察原始对照菌株和3种抗热性菌株个体形态的变化;采用96孔微量酶标板法测定各菌株生物被膜生成能力的强弱;用气相色谱法测定各菌株细胞膜脂肪酸组成的变化及其差异;用差示扫描量热法测定各菌株细胞膜磷脂相变温度的变化;通过聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)法检测各菌株外膜蛋白表达的变化。【结果】大肠杆菌ATCC43889分别经50℃、60℃和70℃各10次热胁迫处理并转接10次培养后,其个体形态变化明显,经50℃热胁迫后,部分菌株由球状体变为长杆状;经60℃热胁迫后的菌株个体形态较50℃热胁迫处理的菌株细长;经70℃热胁迫处理后大部分菌株变成了更细长的杆状,大量的菌株聚集在一起,菌体表面呈凸凹不平的无规则形态。随着热胁迫温度的提高,ATCC43889抗热性菌株的生物被膜生成活力增大,其生物被膜生成能力增强,3种抗热性菌株的生物被膜生成能力与对照组相比差异显著(P0.05)。与对照的原始菌株相比,经过50℃、60℃和70℃各10次热胁迫处理并转接10次培养的菌株,缺失了3种脂肪酸,分别为C18:1n9c、C18:3n3和C21:0,随着热胁迫温度的提高,热胁迫菌株细胞膜中C13:0、C16:0和C17:0等饱和脂肪酸(SFA)及其总含量升高,而C14:1、C16:1、C17:1、C18:1n9t和C18:2n6t等不饱和脂肪酸(USFA)及其总含量降低,总SFA/总USFA比值增大,SFA/USFA比值越大,菌体细胞膜流动性越弱。随着热胁迫温度的提高,ATCC43889抗热性菌株细胞膜磷脂的熔点(Tm)升高,表明细胞膜磷脂的相变温度升高,细胞膜流动性降低,热胁迫温度越高,细胞膜流动性越低;随着热胁迫温度的提高,分子质量在63 kD和75 kD附近的条带颜色逐渐变深,分别经60℃和70℃各10次热胁迫并转接10次培养获得的2种抗热性菌株,其细胞外膜蛋白分子质量在48—75 kD均增加了特异条带;胁迫温度越高,一些外膜蛋白表达量及其种类增加,ATCC43889的耐热性越强。【结论】随着热胁迫温度的升高,ATCC43889个体形态变长,生物被膜生成能力增强,饱和脂肪酸含量升高,不饱和脂肪酸含量下降,细胞膜磷脂的相变温度升高,细胞膜流动性降低,一些外膜蛋白表达量提高、表达种类增加,菌株耐热性增强,这些变化有利于其适应不利的热胁迫环境,提高生存能力。

对取食过无色杆菌毒蛋白的菜粉蝶幼虫血淋巴进行酯酶同工酶聚丙烯酰胺电泳分析，与对照相比，酯酶酶谱发生变化，对照吸光度为处理组的２ ～１０ 倍

【背景】羊大肠杆菌病是一种以剧烈腹泻和败血症为特征的急性传染病,是规模化羊场最为常见高发的细菌性疾病之一,尤其是初生羔羊易被产肠毒素大肠杆菌(ETEC)感染,引起羔羊腹泻,又叫羔羊白痢,使养殖场遭受严重的经济损失。而传统的抗生素治疗方案存在诸多缺陷。【目的】本研究通过让湖羊羔羊口服大肠杆菌F17菌株获得不腹泻和腹泻的羔羊个体,筛选出服用大肠杆菌F17菌毛后不腹泻与腹泻型个体中差异表达的circRNA,进而探究circRNA在绵羊抗腹泻中的作用,从而发现与抗大肠杆菌病性状相关的候选基因。从circRNA层面上,加深对绵羊拮抗大肠杆菌F17菌株的认识,确定绵羊拮抗大肠杆菌F17菌株的功能基因。【方法】用CIRI软件从头预测circRNA,利用RNA-seq技术,首次筛选出感染大肠杆菌F17菌株后不腹泻与腹泻型羔羊个体脾脏中差异表达的(DE)circRNA,对差异表达转录本进行GO富集分析,结合GO注释结果对其功能进行描述。统计每个GO条目中所包括的差异转录本个数,并用Fisher’s exact test计算每个GO条目中差异转录本富集的显著性。然后随机选择6个DE circRNA,利用q-PCR分别验证这6个DE circRNA在不腹泻和腹泻组羔羊脾脏内的相对表达水平,进而利用Miranda软件来预测与miRNA结合的circRNA以及miRNA的靶基因,根据miRNA靶基因的功能注释来阐明此部分circRNA的功能,分析circRNA-miRNA-mRNA相互作用,最后用q-PCR验证circRNA在不腹泻组和腹泻组羔羊体内的相对表达水平。【结果】绘制参考序列后,鉴定出已知的7 730个circRNA,DE circRNA与GO数据库进行比对,发现一共有60条circRNA被注释和分类到297个功能亚类中。利用RNA-seq在不腹泻和腹泻羔羊脾脏中筛选出60个差异表达的(DE) circRNA,其中31个上调和29个下调,用q-PCR验证随机选择的6个DE circRNA在不腹泻组和腹泻组羔羊体内的相对表达水平,发现与RNA-seq结果一致。利用Miranda分析circRNA-miRNA-mRNA相互作用,发现6个circRNA、5个miRNA和8个mRNA之间存在一定的靶标关系,用q-PCR验证mRNA在不腹泻组和腹泻组羔羊体内的相对表达水平,发现与RNA-seq结果一致。【结论】探究了对于不腹泻和腹泻羔羊脾脏中circRNA的表达谱,进一步了解其在绵羊抗病发生过程中的调控作用。发现了不腹泻和腹泻羔羊脾脏中差异表达的circRNA,有助于找出羔羊如何抵抗腹泻的发生机制,为羔羊抵抗腹泻提供科学的依据。

【目的】对宁夏某规模化绵羊场大肠杆菌和艾美耳球虫混合感染进行分离鉴定并对靶器官的组织病理学变化进行分析。【方法】采用固体培养基进行细菌病原分离，饱和盐水漂浮法进行寄生虫检测；采用大肠杆菌16S rRNA引物进行基因序列扩增和测序，使用DNA Star软件将分离菌株测序结果与GenBank中的标准株序列进行同源性比较；采用MEGA 7.0软件中的邻接法，依据16S rRNA序列构建分离株系统发育树并进行遗传进化分析；对靶器官组织进行病理组织学观察。【结果】在伊红美蓝培养基中观察到金属光泽的黑色单一菌落，在血平板中有溶血环的灰色圆形单一菌落，染色为革兰氏阴性杆菌，共分离得到3株菌株；麦克马斯特法检测显示，粪便中有卵圆形，表面光滑的孢子化艾美尔球虫卵囊，其平均OPG为2200，属于轻度感染；对3株菌株16S rRNA扩增片段与阳性对照一致，16S rRNA基因序列构建的系统发育树与大肠杆菌在同一分支；病理组织学观察显示，肠系膜淋巴结淋巴细胞数量减少，有中性粒细胞浸润；肠组织黏膜层绒毛溶解坏死、黏膜上皮结构丢失；回肠固有层内有球虫虫体，呈嗜酸性圆形；空肠间质有中性粒细胞浸润，腺腔有镰刀状球虫裂殖体；结肠局部黏膜有溃疡灶，并有大量弱嗜碱性短杆状物质沉积。【结论】结合病原形态学和分子生物学结果分析表明，该例绵羊群腹泻是由大肠杆菌和艾美尔球虫共同感染所致。

不含有内含子的核盘菌arom基因已经被扩增、测序.该基因编码五功能的AROM蛋白.为了大量获得核盘菌AROM蛋白的结构域之一5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS),将该菌arom基因编码脱氢奎尼酸合酶(DHQS)和EPSPS两结构域的DNA序列和只编码EPSPS结构域的DNA序列分别克隆入载体pGEX-4t-2和载体pET28b中,构建了4个表达载体pGEX-DE、pGEX-E、pET-DE和pET-E,并将其转入大肠杆菌DH5α、大肠杆菌BL21(DE3)或大肠杆菌JM109中表达.酶活测定和SDS-PAGE分析结果显示,上述编码序列在大肠杆菌细胞内获得了表达,含有表达载体pGEX...

[目的]阐明雷帕霉素(Rapa)对大肠杆菌诱发的乳腺感染的保护作用机制,为临床上寻找乳腺炎防控新方法提供理论依据。[方法]原代培养大鼠乳腺上皮细胞,待细胞贴壁后,试验组采用100 nmol·L~(-1)的Rapa处理4 h后,细胞经感染比(MOI)为10的大肠杆菌处理2 h后用细胞刮刀刮取细胞,收集细胞上清液,用于Toll样受体4(TLR-4)及髓样分化因子(MyD88)蛋白、促炎性细胞因子表达及活性氧(ROS)释放检测。[结果]大肠杆菌刺激原代培养的乳腺上皮细胞后,TLR-4和MyD88蛋白表达显著升高;而Rapa预处理可降低MyD88蛋白表达;同时,大肠杆菌刺激后,乳腺上皮细胞中促炎性细胞因子,如肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白介素1β(IL-1β)的表达及ROS的释放均显著升高。雷帕霉素能下调促炎性细胞因子的释放,显著降低ROS的释放量。[结论]Rapa抑制MyD88信号通路后可减轻大肠杆菌诱导的大鼠乳腺炎症反应。

将嗜水气单胞菌粗脂多糖(C-LPS)和大肠杆菌脂多糖(E-LPS)分别经腹腔注射草鱼(剂量为4mg/kg),以注射PBS为对照。48h后,分别提取各组草鱼的头肾、脾脏、肾脏、肝脏和肠组织中的总RNA,利用Real-time PCR的方法检测不同组织中TNF-α、IL-1β、IL-10和TLR4基因的表达情况。结果显示,与对照组相比,头肾中,TNF-α和IL-1β的表达量在E-LPS组显著升高,而IL-10的表达显著下降;C-LPS组TNF-α和IL-10的表达量显著性升高;TLR4在两试验组均有显著性降低。脾脏中,TNF-α、IL-1β和IL-10在E-LPS组与对照组无显著差异,而IL-1β...

为了获得高酶活力的苎麻脱胶果胶裂解酶，为后续分子改造和新型苎麻生物脱胶酶制剂复配提供理论依据。将果胶裂解酶基因pel419从重组质粒pEASY-Blunt E1-pel419更换至pET28a载体中，转化大肠杆菌BL21(DE3)诱导表达；用SDS-PAGE和Western Blot检验pel419基因的表达效果；用生物信息学软件分析Pel419理化表征和系统发育，预测其二级结构、高级结构及关键氨基酸位点。结果表明，工程菌pET28a-pel419/BL21的果胶裂解酶活力为434.4 U/mL,较pEASY-Blunt E1-pel419/BL21提高了1.7倍；Pel419含375个氨基酸，N末端前22个氨基酸为信号肽，理论pI值为6.59,有4个半胱氨酸，不稳定系数为18.20;其蛋白结构域含有典型的右手β-螺旋结构，属于Pec lyase C家族；Pel419的Ca~(2+)结合位点为ASP151、ASP153和ASP192,定位发现3个保守位点均暴露在三维空间的表面，并处于底物结合空间口袋。大幅度提高了Pel419表达量，并获得了Pel419关键结构信息。