针对12株引起凡纳滨对虾急性肝胰腺坏死病(AHPND)的致病性副溶血弧菌,运用多位点测序技术,分析致病菌株的遗传特征。实验选择副溶血弧菌的7个管家基因dnaE、gyrB、recA、dtdS、pntA、pyrC及tnaA,对12株AHPND致病菌扩增测序。将核酸序列上传至PubMLST数据库进行比对后获得每株菌的序列型。收集其他地区AHPND致病性副溶血弧菌的多位点序列分型(MLST)数据,采用eBURSTV3及MEGA5.0软件进行遗传进化分析。结果显示,2014年中国广东分离的AHPND致病株属于一个新

对虾急性肝胰腺坏死病(Acute hepatopancreatic necrosis disease,AHPND)是由致AHPND副溶血弧菌(AHPND-causing Vibrio parahaemolyticus,VpAHPND)携带的pVA1-like质粒所表达的PirA~(Vp)和PirB~(Vp)毒力蛋白对对虾肝胰腺的急性毒性所致。本研究用2.19×10~5 CFU/ml VpAHPND分离株20130629002S01对凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)进行浸泡感染,于感染后2~9 d采集对虾的肝胰腺、鳃、肠道、肌肉组织,采用实时荧光定量PCR方法,检测各组织中的pir AVp拷贝数。结果显示,感染后凡纳滨对虾各组织均能检测到pirA~(Vp),其中,肝胰腺在感染后第4天达到峰值,为8.71×10~4 copies/mg,而鳃、肌肉、肠道分别在第3、4、5天达到峰值,分别为9.08×10~3、2.59×10~4、5.76×10~4 copies/mg。早期感染鳃组织中先出现Vp_(AHPND)的富集,在高死亡发生期,Vp_(AHPND)数量在肝胰腺和肠道出现高峰,在死亡数量逐渐下降的后期,各组织的Vp_(AHPND)均快速下降,肠道、肝胰腺和肌肉中的Vp_(AHPND)水平趋于接近。对虾肝胰腺组织病理切片显示,同一时间有临床症状的病虾和濒死对虾相比,濒死对虾表现出更严重的AHPND病理特征,且二者的组织病理特征均随着感染时间的延长变得更为严重,但检测到的Vp_(AHPND)数量呈下降趋势。研究表明,在Vp_(AHPND)感染过程中,组织中的pirA~(Vp)基因数量不能代表对虾的发病程度,发病程度及组织病理严重的AHPND样品中Vp_(AHPND)的数量不一定处于高水平状态。

根据pir AVp基因保守序列设计特异性引物和TaqMan–MGB探针,经优化反应体系及条件,建立检测致对虾急性肝胰腺坏死病副溶血弧菌(VpAHPND)的TaqMan–MGB探针荧光定量PCR方法;以重组质粒为标准品制作标准曲线,并进行特异性、敏感性、重复性及临床应用试验。结果表明:该方法定量范围宽,起始模板浓度范围为1×101～1×109拷贝/反应时,标准曲线具良好的线性关系;最低检测限约为10拷贝/反应,与对虾其他病原菌及病毒无交叉反应,重复试验变异系数为0.37%～0.47%,可在1 h内完成单个样品检测;对临床对虾样品及水样的检测结果表明,与世界动物卫生组织(OIE)推荐的套式PCR法相比,可提高VpAHPND的阳性检出率,且检测为阳性的样品包含全部套式PCR法检测为阳性的样品。可见,应用TaqMan–MGB探针建立的检测VpAHPND的荧光定量PCR方法具有灵敏度高、特异性强、重复性好、能快速定量等优点,可用于临床对虾样品及水样的VpAHPND检测。

本研究从患急性肝胰腺坏死病(Acute hepatopancreatic necrosis disease,AHPND)的凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)肝胰腺中分离到一株优势菌,编号为20160303005-1,通过16S rRNA和分子伴侣蛋白groEL基因序列分析,并结合生理生化特征,将该细菌鉴定为副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus),其血清型为O1:KUT(K untypeable)。基因分析结果显示,该菌株携带可引起对虾AHPND的相关毒力蛋白基因pirA~(VP)和pirB~(VP),但不携带副溶血弧菌临床菌株毒力基因:耐热直接溶血毒素(Thenmostable direct hemolysin,tdh)和相对耐热直接溶血毒素(TDH-related hemolysin,trh)基因。菌株对凡纳滨对虾具有较强的致病性,浸泡感染的半数致死剂量(LD_(50))为7.96×10~3 CFU/ml。对虾急性感染后,6 h肝胰腺颜色变浅,肠胃变空;9 h肝胰腺呈浅白色,萎缩变小。9 h死亡数过半,24 h全部死亡。组织病理学分析显示,感染后对虾肝胰腺小管崩塌,上皮细胞严重脱落,呈现出典型的AHPND病理症状。药敏实验结果显示,该菌对庆大霉素、环丙沙星和头孢他啶等16种药物敏感,对阿莫西林、替卡西林和头孢噻吩等5种药物表现为耐药。上述研究可为该病原的流行病学及药物防控研究提供基本数据。

近年来包括急性肝胰腺坏死病(AHPND)在内的多种新发疫病的流行,使我国甲壳类养殖业遭受了严重的经济损失。为了筛查导致山东潍坊某养殖场中一虾蟹混养池塘内患病三疣梭子蟹感染的可能病原,本研究采用分子生物学检测方法,对三疣梭子蟹样品进行了白斑综合征病毒(WSSV)、传染性皮下及造血组织坏死病毒(IHHNV)、虾血细胞虹彩病毒(SHIV)、致急性肝胰腺坏死病副溶血孤菌(Vp_(AHPND))、虾肝肠胞虫(EHP)、偷死野田村病毒(CMNV)、黄头病毒(YHV)和肝胰腺细小病毒(HPV)等8种病原的检测,并对样品进行了组织病理和原位杂交分析。分子生物学检测结果显示,患病三疣梭子蟹样品呈Vp_(AHPND)阳性,而呈现WSSV、IHHNV、SHIV、EHP、CMNV、YHV和HPV阴性。对样品进行Vp_(AHPND)套式PCR第二轮扩增产物的序列测定、比对和进化树分析,结果显示,扩增产物序列与致病副溶血弧菌质粒上pirA~(vp)毒力基因片段具有99%的同源性,该序列与已报道的多个致病副溶血弧菌PirA聚在进化树的同一主分支上。组织病理学分析显示,患病三疣梭子蟹的肝胰腺小管上皮细胞坏死,心肌纤维呈溶解样病变,鳃丝上皮柱突细胞明显坏死,胸神经节的神经细胞损伤严重,并且这些组织中还可见大量的细胞核固缩现象;原位杂交结果显示,肝胰腺、心肌、鳃组织及胸神经节中的病变部位均存在Vp_(AHPND)探针的蓝紫色杂交信号。以上表明,虾蟹混养池塘中三疣梭子蟹在自然状态下感染了Vp_(AHPND),并导致肝胰腺、心肌、鳃和胸神经节发生了严重病理损伤。本研究首次在养殖三疣梭子蟹中检测到Vp_(AHPND)感染并揭示了感染所致的病理变化,相关结果为揭示Vp_(AHPND)自然宿主种类和养殖三疣梭子蟹病害防控提供了基础信息。

为查明上海市奉贤区某对虾养殖场疑似患急性肝胰腺坏死病的凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)的病原菌，本研究从患病凡纳滨对虾肝胰腺组织分离纯化到1株优势菌FHBX-1,并通过人工回归感染试验确定其致病性，利用VITEK-2全自动微生物鉴定仪和16S rRNA、热休克蛋白HSP60基因序列分析进行综合鉴定，并检测其毒力基因。同时采用K-B纸片扩散法检测病原菌的药物敏感性并通过石蜡切片观察患病凡纳滨对虾肝胰腺组织的病理特征。结果显示：菌株FHBX-1经生理生化特征测定、16S rRNA和热休克蛋白HSP60基因序列分析，综合鉴定为副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus),且携带了急性肝胰腺坏死病相关的毒力基因pirA~(VP)、pirB~(VP),未携带副溶血弧菌临床主要毒力基因耐热直接溶血毒素tdh和相对耐热直接溶血毒素trh基因。人工回归感染试验结果显示，凡纳滨对虾在菌液浓度为1.0×10~6 CFU/mL浸泡感染试验组，7 d内累计死亡率为80%,患病凡纳滨对虾具有肝胰腺颜色变白、萎缩变小，胃肠变空等症状，从病虾再次分离的优势细菌与原攻毒菌FHBX-1特性相同。组织病理学观察显示，患病凡纳滨对虾肝胰腺上皮细胞严重脱落，肝小管崩塌，呈典型的AHPND病理特征。药敏试验结果表明，菌株FHBX-1对氟苯尼考、多西环素、恩诺沙星等11种抗菌药物敏感，对新霉素、红霉素中度敏感，对链霉素、庆大霉素等5种抗菌药物耐药。本研究可为对虾急性肝胰腺坏死病的流行病学研究及药物防控提供基础依据。

急性肝胰腺坏死病(AHPND)是对虾养殖过程中最常见、最严重的疾病，给对虾养殖造成重大经济损失。AHPND病原种类多、基因型复杂，现有的针对不同病原的检测技术目标导向较弱、检测成本高、时间消耗长，对虾健康养殖亟待开发AHPND的精准快速诊断技术。本研究针对AHPND病原体携带编码一种二元毒素pirA和pirB大型质粒的遗传共性，基于pirA和pirB基因设计特异性引物并建立微流控荧光定量PCR检测方法。该方法对致病基因pirA和pirB特异性强、灵敏度高，最低检测限分别为5.43×10~0和4.31×10~1 copies/μL，样品平均检测时间为26min左右。为进一步评估该方法在实际应用中的准确性，以含有pirA和pirB毒性质粒的副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)进行人工感染实验。结果表明，感染后的凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)鳃丝、肝胰腺、肠道和肌肉等组织随时间的推迟均能检测到pirA和pirB；从感染2h的结果来看，pirB比pirA检出率更高。此外，致病因子pirA和pirB比toxR的检出率更高，更适合对AHPND致病原的检测。本研究建立的微流控荧光定量PCR检测的方法具有快速、灵敏、高通量、污染少、现场检测、一体化集成等优点。该技术不仅适用于实验室，更符合养殖基层的现场快速检测需求，为及早认知疾病发生风险和病害精准防控提供了新的技术手段与理论支撑。

为了研究致病性副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)对凡纳滨对虾(Litopanaeus vannamei)肝胰腺抗氧化酶活性及相关基因表达的影响,本研究选取始体重(2.20±0.24)g的健康凡纳滨对虾初270尾,将其随机分为2组,分别以0 CFU/m L和5×107 CFU/m L剂量的致病性副溶血弧菌对凡纳滨对虾进行浸浴攻毒实验。在实验第6小时、12小时、24小时和36小时取肝胰腺,进行抗氧化酶活性及免疫相关基因表达测定。结果显示,感染副溶血弧菌后,实验组对虾肝胰腺中超氧化物歧

为评估基因型鉴定芯片在育种群体构建中的应用价值，实验对凡纳滨对虾3个群体(EE、PP和SS)进行急性肝胰腺坏死病(AHPND)副溶血弧菌(Vp_(AHPND))侵染实验，利用自主研发的40K SNP液相芯片“黄海芯1号”获得146尾个体的基因型信息，对群体遗传背景进行了系统调查并估算了AHPND抗性遗传力。Vp_(AHPND)浸染实验结果显示，不同群体间存在抗病差异，PP群体的存活性能比EE和SS群体分别高出12.9%和11.6%。利用质控后的38 148个SNP信息构建系统进化树，结果显示群体内同一个家系的个体首先聚在一起，进而同属一个群体的多个家系聚在一起。主成分和遗传结构分析显示，可以准确地将146尾个体划分为3个组，与系统进化树聚类结果一致。遗传多样性分析显示，3个群体的观测杂合度(H_o)平均值为0.25～0.29，多态信息含量(PIC)平均值为0.20～0.23，上述遗传参数达到极显著水平。3个群体间的遗传分化系数(F_(ST))为0.11～0.21，存在中高度遗传分化。基因组近交分析表明，EE、PP和SS群体的近交系数均值分别为-0.05±0.06、0.20±0.09和0.37±0.07，后2个群体内部分个体表现出较高的近交水平。使用ssGBLUPMF (Single Step Genomic BLUP with Metafounders)模型，复合基因型、表型和系谱信息，获得Vp_(AHPND)侵染后存活状态的遗传力估计值为0.24±0.07，表现为中等水平，表明基础群体具有较好的选育潜力。研究表明，利用液相芯片“黄海芯1号”开展辅助育种，可以进一步提高基础群体构建和评估的效率。

为开展凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)生长和急性肝胰腺坏死病(acute hepatopancreatic necrosis disease， AHPND)抗性复合选育，本研究以自主选育的凡纳滨对虾高抗和快大品系为研究对象进行生长和AHPND抗性测试。实验家系共计70个(高抗家系40个，快大家系30个)，实验个体共计1 760尾(高抗个体800尾，快大个体960尾)。2个品系分2批次进行Vp_(AHPND)定量口饲感染。批次内实验个体达半数死亡后停止投喂毒饵。利用个体动物模型和父母本阈值模型评估2个品系3 个性状(体重、感染Vp_(AHPND)后个体存活时间、家系半致死存活率)的遗传力；利用两性状动物模型评估3个性状两两之间的遗传相关。结果显示，高抗系体重遗传力估计值为0.599±0.120，为高遗传力水平；个体存活时间遗传力估计值为0.240±0.072，为中等遗传力水平；家系半致死存活率遗传力估计值为0.173±0.051，为低等遗传力水平。快大系体重、个体存活时间和家系半致死存活率的遗传力估计值分别为0.266±0.082、0.374±0.096、0.257±0.048，均为中等遗传力水平。经Z-score检验，2个品系各性状遗传力估计值与0差异均达到极显著水平(P<0.01)。2个品系内的体重与AHPND抗性性状(个体存活时间、家系半致死存活率)遗传相关均表现为低度正相关(0.061～0.235)，且与0差异不显著(P>0.05)；2个品系内的个体存活时间与家系半致死存活率遗传相关分别为0.997±0.129、0.967±0.044，为高度正相关。结果表明，在实际选育过程中，可将生长和AHPND抗性作为选育指标纳入综合选择指数进行选种制种；为简化抗性测试过程，可将家系半致死存活率作为选育群体的AHPND抗性指标。本研究为开展凡纳滨对虾生长和AHPND抗性优良品种的选育提供了参考。

为预报池塘养殖凡纳滨对虾急性肝胰腺坏死病(AHPND)的发生，自2020年开始，笔者对凡纳滨对虾(Penaeus vannamei)养殖区开展了连续监测工作，包括与疾病发生相关的环境理化因子、微生物因子、虾体自身健康状况等18个候选预警因子指标，通过数据标准化处理后分析病原、宿主与环境之间的相关性关系，对候选预警因子进行筛选，基于Python语言编程结合Deep Forest、LightGBM、XGBoost算法进行数据建模和预测性能评判，仿真环境为Python2.7，以预警因子指标作为输入样本(即警兆)，以对虾是否发病指标作为输出结果(即警情)，根据输入样本和输出结果各自建立输入数据矩阵和目标数据矩阵，利用原始数据矩阵对输入样本进行初始化，结合函数方程进行拟合，拟合的源代码能利用已知环境、病原及对虾免疫指标数据对目标警情的预测。最终建立了基于Deep Forest算法的虾体(肝胰腺内)细菌总数、虾体弧菌(Vibrio)占比、水体细菌总数、盐度的4维向量预警预报模型，准确率达89.00%。本研究利用人工智能算法应用到对虾AHPND发生的预测预报，相关研究结果为对虾AHPND疾病预警预报建立了预警数学模型，并为对虾健康养殖和疾病防控提供了技术支撑和有力保障。

为探讨养殖水体中总氨氮胁迫对凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)"急性肝胰腺坏死综合征(Acute Hepatopancreatic Necrosis Syndrome,AHPNS)"发生的影响,设置了1个对照组和4个不同质量浓度氨氮实验组:2.5、5.0、7.5、10.0 mg/L实验组,胁迫20 d后腹肌注射副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)进行感染。凡纳滨对虾感染后6–24 h,除对照组外,各实验组均出现死亡高峰。24 h后,5.0、7.5和10 mg/L实验组对虾累积死亡率均高于2.5 mg/L组,且在同一取样时间各实验组对虾累积死亡率随着氨...

【目的】检测广西沿海地区凡纳滨对虾源副溶血弧菌的耐药性及部分相关耐药基因的携带状况,为凡纳滨对虾疾病防控以及副溶血弧菌耐药机制的深入研究提供基础数据。【方法】采用K-B纸片扩散法检测30株分离自广西钦州市、防城港市和北海市的副溶血弧菌对12种常见抗生素的耐药性,以PCR方法检测氨基糖苷类耐药基因ant(3")-I、磺胺类耐药基因Sul1、四环素类耐药基因tet(A)和β-内酰胺类耐药基因TEM在副溶血弧菌中的携带状况,通过SPSS软件进行菌株耐药表型和耐药基因的相关性分析。【结果】30株副溶血弧菌对试验药物的敏感率以氟苯尼考最高(96. 7%),其次是链霉素(90. 0%);耐药率以磺胺二甲嘧啶和青霉素G最高(均为96. 7%)。优势耐药谱型是SDM/SMD/PG/AMP和SMD/PG/AMP。PCR检测结果,ant(3")-I、Sul1、tet(A)、TEM基因的检出率分别为6. 7%、43. 3%、0. 0%和13. 3%。受试菌株共包含ant(3")-I-Sul1+tet(A)-TEM-、ant(3")-I-Sul1-tet(A)-TEM-、ant(3")-I-Sul1-tet(A)-TEM+、ant(3")-I+Sul1-tet(A)-TEM-和ant(3")-I-Sul1+tet(A)-TEM+5种耐药基因型,其中优势耐药基因型是ant(3")-I-Sul1+tet(A)-TEM-和ant(3")-I-Sul1-tet(A)-TEM-,各占40. 0%。相关性分析结果,氨基糖苷类、磺胺类、四环素类、β-内酰胺类抗生素耐药表型与对应耐药基因之间均未发现存在显著相关性。【结论】30株广西沿海凡纳滨对虾源副溶血弧菌对氟苯尼考最敏感,对磺胺二甲嘧啶和青霉素G耐药性最强;受试菌株共包含5种耐药基因型,优势耐药基因型是ant(3")-I-Sul1+tet(A)-TEM-和ant(3")-I-Sul1-tet(A)-TEM-。菌株的4类抗生素耐药基因与耐药表型之间均未发现存在显著相关性。

【目的】检测广西凡纳滨对虾源副溶血弧菌的耐药性和整合子—基因盒携带情况,为凡纳滨对虾副溶血弧菌病的防控及该菌耐药分子机制研究提供基础数据。【方法】采用K-B纸片扩散法测定副溶血弧菌对16种抗菌药物的敏感性;采用PCR检测I、II和III型整合子及I型整合子可变区基因盒的携带情况,并分析菌株整合子—基因盒携带情况与耐药性的相关性。【结果】104株广西凡纳滨对虾源副溶血弧菌对16种抗菌药物表现出不同程度的敏感性,其中,对氟苯尼考(FFC)的敏感性最高,敏感率达82.7%;对磺胺间甲氧嘧啶(SMM)、磺胺二甲嘧啶(SM2)和复方磺胺嘧啶(SD)的耐药性较强,耐药率达93.3%～100.0%。在2013-2018年,广西凡纳滨对虾源副溶血弧菌共有20种耐药谱,其中优势耐药谱为SD/SM2/SMM/SMD/SXT/RAD。PCR扩增结果表明,I型整合酶int1基因检出率为64.4%,sul1和qacEΔ1基因检出率分别为25.0%和27.9%。int1、sul1和qacEΔ1基因均为阳性的菌株检出率为22.1%。在int1、sul1和qacEΔ1基因均为阳性的菌株中,有6株检出携带基因盒,基因盒种类包括blaCTX-M-2-aadA1和blaVIM-60-aadA1-aacA。所有菌株均未检出II和III型整合酶基因。int1和qacEΔ1基因在广西北海市、钦州市和防城港市分离菌株中的检出率差异显著(P0.05,下同);头孢拉定(RAD)的耐药表型与blaCTX-M-2和blaVIM-60基因、新霉素(NEO)的耐药表型与aadA1和aacA基因、磺胺类的耐药表型与sul1基因均无显著相关性。【结论】广西凡纳滨对虾源副溶血弧菌对氟苯尼考的敏感性最高,可考虑将该抗菌药物作为广西凡纳滨对虾副溶血弧菌病防治的备选药物。副溶血弧菌对大部分抗菌药物的耐药表型与int1基因间未检测到显著相关性、基因盒与相应抗菌药物的耐药表型间相关性也不显著,但I型整合子的流行增加了广西凡纳滨对虾源副溶血弧菌产生多重耐药的可能性,因此应加强对弧菌整合子—基因盒的监控。

以凡纳滨对虾（Ｌｉｔｏｐｅｎａｅｕｓ ｖａｎｎａｍｅｉ）为研究对象，采用人工感染、ｔｒｉｃｉｎｅ－ｓＤｓ－ｐａＧｅ、Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂＬｏｔｔｉｎＧ、ｍａＬＤｉ－ｔｏＦ／ｔｏＦ、抑菌实验等方法对血蓝蛋白小分子降解肽段进行研究。结果发现，副溶血弧菌（ｖｉｂｒｉｏ ｐａｒａｈａｅｍｏＬｙｔｉｃｕｓ）刺激对虾２４ ｈ后，与对照组相比，其血淋巴中新出现５个分子量为６．０～３１．０ ｋ Ｄ的与兔抗血蓝蛋白抗体呈阳性的小分子条带。其中，分子量为６．０ ｋ Ｄ的ａ条带（命名为ｈｍｃｐ６肽段）与凡纳滨对虾血蓝蛋白具有高度同源性，对副溶血弧菌具有明显的抑菌活性，与对照组相比，存在极显著性差异（ｐ＜０．０１）。由．．．