【目的】丙酮酸激酶(pyruvate kinase,PYK)是一种调节性糖酵解酶,负责调节糖酵解和糖异生之间的平衡,具有重要的生理作用。本研究通过分析异色瓢虫(Harmonia axyridis)3条HaPYK的序列结构,并结合RNA干扰(RNAi)技术,探讨HaPYK在瓢虫体内的生物学功能。【方法】基于从异色瓢虫全基因组中获得的3条HaPYK序列(被分别命名为HaPYK1-1、HaPYK1-2、HaPYK2),通过生物信息学方法分析其理化性质和序列结构,以及与其他昆虫之间的同源性。然后采用显微注射的方法将体外合成的dsRNA导入羽化第1天成虫体内,在注射后48和72 h分别收集试验材料,提取虫体总RNA后进行反转录,随后采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)技术测定3个HaPYK的表达水平以评估RNAi效果,并检测与海藻糖代谢相关基因的表达水平,最后检测葡萄糖、糖原、海藻糖含量以及两种海藻糖酶的活性。【结果】HaPYK1-1、HaPYK1-2、HaPYK2的开放阅读框分别为1 350、1 569、1 656 bp;蛋白大小分别为449、522、551 aa,理论等电点分别为5.04、5.02、5.01。保守结构域预测表明3条HaPYK均属于Pyruvate_kinase超家族。HaPYK二级结构主要是α-螺旋和无规则卷曲,另外也含有延伸链和β-转角。3条序列的寡聚物类型均为同源四聚体。系统进化树显示,HaPYK与同为鞘翅目的昆虫具有较近的亲缘关系,如马铃薯甲虫(Leptinotarsa decemlineata)和赤拟谷盗(Tribolium castaneum)。注射ds HaPYK1-1后,HaPYK1-2和HaTRE1-4的表达量显著下调,而HaPYK2、HaTRE1-1、HaTRE1-2、HaTRE2-like、HaTPS的表达量显著上调;注射ds HaPYK1-2后,HaTRE1-1、HaTRE1-2、HaTRE1-3、HaTRE1-5、HaTRE2、HaTPS的表达量显著上调;注射ds HaPYK2后,仅HaTRE1-1表达量在48 h表现为显著上调,HaTRE1-3、HaTRE1-4、HaTRE1-5、HaTRE2、HaTRE2-like的表达量均下调。与对照组相比,在ds HaPYK1-2组中48 h时可溶性海藻糖酶(TRE1)活性显著降低,海藻糖和糖原含量显著增加;在ds HaPYK1-1或ds HaPYK2组中48 h时葡萄糖含量减少,72 h时葡萄糖、海藻糖含量增加,膜结合型海藻糖酶(TRE2)活性显著提高;在ds HaPYK2组48 h时,海藻糖含量显著减少,而糖原含量显著增加。【结论】异色瓢虫体内存在3个HaPYK,通过导入外源ds HaPYK能成功干扰靶标基因的表达水平,且抑制表达后海藻糖代谢会受到影响,但3个HaPYK的调控机制不尽相同。

应用RT-PCR和RACE法从麻疯树总RNA中分离出pepc基因全长cDNA,长度为3 142 bp,阅读框2 898 bp,编码965个氨基酸,在GenBank中登录,序列号为EU069413。它的氨基酸序列与蓖麻、陆地棉、橙、大豆、花生、烟草、油菜、拟南芥的氨基酸同源性分别为94.94%、92.46%、90.60%、90.50%、90.50%、88.33%、84.61%、82.44%。该基因编码了pepc基因家族中的pepc1,蛋白属于C3型PEPC。推测了pepc编码蛋白分子量为110.6 kD,并对其稳定性、二级结构、疏水性等特性进行了分析,最后确定了该蛋白的功能位点和结构域。

【目的】克隆苹果（Ｍａｌｕｓ×ｄｏＭｅｓｔｉｃａ Ｂｏｒｋｈ．）多个代谢途径中的关键酶磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶（ｐｈｏｓｐｈｏｅｎｏｌｐｙｒｕｖａｔｅ ｃａｒＢｏｘｙｋｉｎａｓｅ，ｐｅｐｃｋ）基因Ｍｄｐｃｋｓ，研究其在不同组织器官及不同胁迫处理条件下的表达特性，为解析该基因在多个代谢途径中的功能奠定基础。【方法】利用同源比对和ｒｔ－ｐｃｒ技术，克隆获得Ｍｄｐｃｋ１和Ｍｄｐｃｋ２全长ｃｄｎａ序列并进行生物信息学分析；克隆Ｍｄｐｃｋｓ的启动子序列，利用ｐｌａｎｔｃａｒｅ软件在线分析启动子上的顺式作用元件；采用实时荧光定量ｐｃｒ（ｑ ｒｔ－ｐｃｒ）检测Ｍｄｐｃｋｓ在不同组织中的表达以及在水杨酸（ｓａ．．．

利用农杆菌介导的转化方法研究OsPK1过表达对水稻的影响。将CaMV 35S启动子驱动的OsPK1的全长CDS序列导入到日本晴基因组中。选择3个过表达转基因系作为代表进行鉴定和分析。结果显示,过表达植株在株高、分蘖数、穗长和千粒重四方面接近野生型水稻,结实率略下降,但每穗饱满种子数明显增加。通过定量RT-PCR分析,发现有4个代谢酶在过表达植株嫩叶中表达存在着上调或下调。用GC-MS方法检测糖含量,显示OsPK1过表达株系中葡萄糖、果糖、半乳糖和蔗糖的含量与野生型差异不大。总之,对OsPK1过表达株系的鉴定,有助于更好了解OsPK1的功能,并且每穗饱满种子数明显增加具潜在的应用价值。

研究了水温从17℃突变为27℃对凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)稚虾己糖激酶(HK)和丙酮酸激酶(PK)活力及热休克蛋白(HSP70)表达的影响。主要结果如下:(1)温度突变后,凡纳滨对虾肝胰脏中己糖激酶活力逐渐增大,温度突变后3h达到最高,是温度突变前的2.54倍(P<0.05)。随后,对虾己糖激酶的活力逐渐下降,72h酶活力基本恢复到温度突变前的水平。(2)温度突变后1h,凡纳滨对虾丙酮酸激酶的活力降到最低,随后逐渐增大;6h达到最高,随后对虾丙酮酸激酶的活力逐渐下降并在72h恢复到温度突变前的水平。(3)温度突变0.5h后,凡纳滨对虾肌肉中HSP70的表达量迅速升高...

光合生物通过光合作用,可将光能转化为储存在生物体内部的生物质能,生物质能的生成速率受光合生长速率的影响.研究影响光合生长速率的因素,有利于提高生物质能的生成速率.蓝藻是最早进行光合作用和释氧的原核生物,具有遗传背景简单、固碳效率高等特点.丙酮酸铁氧化还原蛋白酶(PFOR)是丙酮酸固碳代谢的关键酶,在丙酮酸异化过程中起着重要作用.首先根据蓝藻的代谢网络,模拟敲除其中的酶PFOR,并利用通量平衡分析、通量可变性分析和多目标优化方法研究基因敲除后的代谢网络.通过研究分析,推测出酶PFOR对蓝藻光合生长速率的影响.

【目的】异色瓢虫(Harmonia axyridis)是一种重要的捕食性天敌昆虫,广泛应用于农林害虫的生物防治中。本研究旨在分析探索低温胁迫条件对3个小分子热激蛋白(small heat shock protein,s HSP)抗寒基因相对表达量的影响,为异色瓢虫低温冷藏及其抗寒机制研究提供科学依据。【方法】在转录组获得异色瓢虫基因序列的基础上,根据特异性引物获得HaHSP47.74(基因登录号:KX161871)、HaHSP21.53(基因登录号:KX161873)和HaHSP21.52(基因登录号:K

肌酸激酶(Creatine kinase,CK)能够催化磷酸基团在二磷酸腺苷(ADP)和磷酸肌酸间的可逆性转移,在细胞能量代谢过程中发挥重要作用。以虹鳟(Oncorhynchus mykiss)为研究材料,使用RT-PCR和RACE法分离和克隆了虹鳟脑型肌酸激酶(CKB)基因cDNA的全长序列(GenBank登录号:FJ548753)。序列全长1493bp,其中5′端非翻译区81bp,3′端非翻译区266bp,开放性阅读框1146bp,编码381个氨基酸。虹鳟鱼CKB蛋白存在两个重要功能结构域,分别为EF-hand结构域和ATP:guanido磷酸转移酶结构域。构建的系统进化树证实所克隆的肌酸...

为了获得一个优良的玉米抗旱育种基因资源,借助于生物信息学手段和分子生物学实验操作技术,从木棉植物中获得了一个编码海藻糖-6-磷酸合成酶的抗旱基因序列。根据玉米对密码子使用的偏爱性,合成了1个可用于玉米转化并提高其耐旱性的新的海藻糖-6-磷酸合成酶基因,进一步通过DNA分子的酶切和连接等操作将该基因构建成表达质粒,再导入大肠杆菌和酵母细胞以鉴定其是否能在原核和真核细胞中表达。最后该基因被构建到植物表达载体上,并转入农杆菌细胞。结果表明,新合成基因全长为2 586 bp,包含完整的开放阅读框,编码861个氨基酸;构建出的原核和真核表达质粒与预期的结果相符,该基因可用于细胞转化试验;该新合成基因能在大肠杆菌和酵母细胞中有效表达出海藻糖-6-磷酸合成酶;该基因被成功构建到植物表达载体p CAMBIA-2300上,并转入了农杆菌细胞LBA4404工程菌株。综合上述结果认为,获得了1个新的海藻糖-6-磷酸合成酶基因,该基因能在原核和真核细胞中有效表达出海藻糖-6-磷酸合成酶,构建的植物基因表达质粒可以直接用于玉米抗旱转基因育种。

为解析谷子磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC,Phosphoenolpyruvate carboxylase)在非生物逆境胁迫下的响应特征。从谷子基因组中鉴定出一个Si PEPC(Seita. 1G020700)基因,利用相关软件对其氨基酸序列、蛋白特征、功能、信号途径、顺势应答元件等参数特征进行分析和预测,随后分析了该基因在幼苗期逆境胁迫下的动态表达模式及在拔节期、抽穗期、灌浆期不同光照处理和干旱胁迫下的表达。结果表明,该基因位于谷子1号染色体,基因组序列长6 652 bp,编码965个氨基酸,基因无可变剪切、不含内含子;功能域分析显示,该基因含PEPC基因的特征结构域;多序列比对发现,该PEPC蛋白与其他植物PEPC蛋白非常相似,具有非常保守的序列结构。实时荧光定量PCR分析表明,Si PEPC(Seita. 1G020700)在ABA、低温、PEG、高盐胁迫下表达量均有所上调,其中,在ABA处理时,表达量呈现波动,在12 h被诱导达到峰值。在低温处理时,表达量持续上升,在24 h达到峰值;在PEG和Na Cl处理时表达量整体呈上升趋势,均在12 h达到峰值,在24 h其表达量均急剧下降。进一步研究表明,Si PEPC基因在拔节期和抽穗期正常光照强度下参与了对干旱胁迫的响应,推测Si PEPC(Seita. 1G020700)基因参与了谷子对非生物逆境的应答,可能在干旱和其他逆境胁迫信号途径中起关键作用。

磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPCase)是控制植物籽粒中蛋白质/油脂含量比例的关键酶。本研究利用RT-PCR技术,克隆PEPCase基因的片段,并将克隆的PEPCase基因片段反向连接替代植物表达载体PBI121的GUS基因。从花生栽培品种荔蒲大花生基因组中克隆获得编码PEPCase的基因片段(886 bp),其核苷酸序列与已报道的花生(EU391629)、棉花(AY008939)、大豆(D10717)、拟南芥(AY210895)、豌豆(D64037)PEPCase基因对应部分的同源性分别为99.77%,84.37%,81.54%,81.25%,78.71%,说明我们得到PEPCase基因片段...

为分析牙鲆碱性磷酸酶基因5'调控区和第一内含子调控序列的功能,本研究运用DNA重组技术将PCR扩增得到的牙鲆碱性磷酸酶基因的5′调控区序列、第一内含子序列及5′调控区和第一内含子串联序列分别插入启动子缺失的增强型绿色荧光蛋白表达载体pAcGFP1-1中,得到pAcGFP1-5′ALP、pAcGFP1-Intron1和pAcGFP1-AI报告基因表达载体。通过脂质体介导重组质粒转染中国仓鼠卵巢细胞(CHO)并检测荧光信号。转染后细胞状态良好,24 h后发现,在倒置荧光显微镜下均可看到不同强度的绿色荧光信号,且荧光信号随时间的延长而增强,其中转染pAcGFP1-AI后的荧光信号强度最强。以上结果表...

海藻糖为一种非还原性糖,广泛存在于细菌、藻类、真菌、植物和无脊椎动物中。海藻糖被称为昆虫"血糖",源于该糖为昆虫血淋巴中的主要糖类物质,在昆虫生长、发育、蜕皮等正常生理活动中有着重要的作用。昆虫的海藻糖先由海藻糖合成酶(trehalose-6-phosphate synthase,TPS)生成海藻糖-6-磷酸,然后通过海藻糖磷酸脂酶(trehalose-6-phosphate phosphatase,TPP)最终合成海藻糖,在能量需求时通过海藻糖酶(trehalase,TRE)降解为葡萄糖,用于能量供给。