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[期刊] 中国水产科学
[作者]
李亚亚 陈松林 林帆 王娜 刘洋 黄进强
利用半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)dmrt1基因和青鳉(Oryzias latipe)dmrt1基因构建过表达载体,采用显微注射技术将两种载体分别导入青鳉受精卵中,比较异源和同源dmrt1基因对青鳉胚胎孵化率的影响以及两种dmrt1基因在青鳉体内的基因整合率、基因表达率及对芳香化酶基因(cyp19a)表达的影响。结果表明,注射48 h后,两种载体均在胚胎内大量表达,注射青鳉同源性dmrt1载体的受精卵孵化率(69.5%)要显著高于注射异源性dmrt1载体的受精卵(36.5%)。30 dph(days post hatching)两组被注射稚鱼均能检测到基因整合,注射同...
[期刊] 华北农学报
[作者]
赵军良 巫东堂 王秀英 李改珍 巫一伦
减数分裂是有性繁殖的重要过程。已经发现,在玉米和拟南芥中,同源联会缺乏基因1(phs1),只允许同源染色体联会,而阻止非同源染色体联会。为了研究phs1在拟南芥中的表达,从拟南芥基因组中通过PCR扩增出phs1启动子,然后将phs1及其启动子克隆到含荧光表达蛋白GFP、YFP的表达载体上,最后将构建好的载体转化到根癌农杆菌中,用来转化拟南芥。
[期刊] 中国农业大学学报
[作者]
张好放 郁二蒙 王广军 余德光 李志斐 谢骏
为研究TGF-β1/Smad4信号通路在草鱼(Ctenopharyngodon idellus)肌肉发育过程中的作用机制,首先克隆了草鱼TGF-β1、Smad4基因开放阅读框(ORF,Open reading frame)序列各1 134和1 644bp。其次,在TGF-β1、Smad4序列两端分别加上相应的酶切位点,同时对pcDNA3.1(+)真核表达载体进行双酶切,将带酶切位点的片段正向插入到真核表达载体pcDNA3.1(+)中,构建TGF-β1、Smad4基因的真核过表达载体pcDNA3.1(+)-
关键词：
草鱼 克隆 真核表达载体 RNA干扰
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
李玲玲 张伟 杜蕊 宋玲珍 柴学军 胡新德 陈树林 赵善廷
【目的】构建能够在神经系统中高效表达的小鼠cofilin-1野生型(Cfl1-wt)、活化型(Cfl1-S3A)、失活型(Cfl1-S3D)3种真核表达载体,并研究其在鸡胚脊髓神经元中的表达情况,为进一步探讨cofilin-1在大脑发育过程中对神经元迁移的影响奠定基础。【方法】从成年小鼠大脑组织中提取RNA,经反转录获得cDNA样本,RT-PCR扩增小鼠cofilin-1基因的CDS区,经引物设计引入点突变,扩增了野生型、活化型及失活型的cofilin-1基因片段,克隆入pCAG-MCS-myc真核表达载体中。经双酶切和测序鉴定后,转染CHO细胞,通过半定量RT-PCR和免疫荧光染色检测其在细...
[期刊] 华北农学报
[作者]
杨志如 云锦凤 魏建华 徐春波
为研究冷诱导转录因子CBF1(C-repeat-binding-factor)基因对我国优良豆科牧草——苜蓿的抗寒性的改良作用,试验从拟南芥(Arabidopsis thaliana)中利用PCR方法分离了CBF1基因及其启动子,分别构建了CaMV 35S启动子和来源于拟南芥的CBF1启动子驱动的农杆菌介导的植物转化表达载体,为下一步研究利用CBF1基因改良苜蓿抗逆性奠定了基础。
[期刊] 华北农学报
[作者]
张森燕 吴忠义 张秀海 刘占磊 王永勤 黄丛林
构建了ZmPti1基因的正义表达载体和RNAi载体,以bar基因为抗性筛选标记,通过花粉管通道法将构建的两个表达载体分别转化到玉米自交系178。收获的种子播种于营养钵中,出苗后,经0.1%的草丁膦筛选得到40株草丁膦抗性植株,进一步用PCR鉴定与PCR-Southern检测得到33株转基因植株,其中15株是转化正义表达载体的转基因植株,18株是转化RNAi表达载体的转基因植株。并对转化方法和ZmPti1基因的功能进行了讨论。
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
曾国航 徐宏伟 李莲瑞
【目的】构建新疆多浪羊ＩＬ－１β基因编码区的原核表达载体，在大肠杆菌中进行诱导表达，为进一步研究ＩＬ－１β蛋白的结构功能奠定基础。【方法】从含质粒ｐＭＤ－１８Ｔ－ＩＬ－１β的大肠杆菌ＤＨ５α中获取ＩＬ－１β基因，与ｐＥＴ－２８ｂ质粒ＤＮＡ连接，构建原核表达载体ｐＥＴ－２８ｂ－ＩＬ－１β。先将其转化到克隆载体Ｅ．ｃｏＬＩ ＤＨ５α感受态细胞中大量拷贝，经菌液ｐｃＲ和ＥｃｏＲⅠ、ＸＨｏⅠ双酶切鉴定后，提取ｐＥＴ－２８ｂ－ＩＬ－１β质粒转化到表达载体Ｅ．ｃｏＬＩ ｂＬ２１（ＤＥ３）中，再次进行菌液ｐｃＲ和ＥｃｏＲⅠ、ＸＨｏⅠ双酶切鉴定。将阳性单克隆接种于Ｌｂ液体培养基，以终浓度为１ＭＭｏＬ／Ｌ Ｉｐ．．．
关键词：
多浪羊 IL-1β基因 原核表达
[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
张芸 李会 车丽玲 黄思齐 邱承祥 杨志敏
MicroRNAs(miRNAs)是一类内源性长度约为21～24个核苷酸,在基因表达、生长发育、细胞周期及环境胁迫等方面起着重要作用的单链非编码小分子RNA。研究表明:植物miRNAs通过转录后以切割的方式对其靶基因的表达起着负调控作用。miR395的靶基因分别为ATP硫酸化酶和硫转运体SULTR2;1,两者在硫同化及转运中起着重要的作用。为了进一步探究miR395的功能,本研究利用PCR法从拟南芥中克隆了miR395d前体基因,并与pCAMBIA1304载体连接,构建了miR395d前体基因的过量表达载体,通过根癌农杆菌介导法将其转化到甘蓝型油菜特选4号中,目前已获得了转基因植株。
[期刊] 华北农学报
[作者]
刘焕焕 朱志炎 刘之恩 何勇 张德清 田志宏
为了探究水稻油菜素内酯不敏感1相关受体激酶1前体物质OsBAK1P对水稻相关农艺性状的影响。通过以中花11粳稻品种为材料，根据基因所设计的特异性引物从水稻穗部cDNA中扩增得到CDS片段大小为651 bp的目的序列片段；通过酶切酶连的方法成功构建了PTCK303-OsBAK1P过表达载体和PTCK303-OsBAK1P RNA干扰载体；用农杆菌EHA105菌株转化表达正确的载体质粒并利用基因CDS扩增引物检测菌落筛选出阳性农杆菌克隆；再利用农杆菌遗传转化法侵染中花11粳稻品种的愈伤组织从而获得转基因植株；最后，相比较于中花11挑选2个表型相似的过表达、RNA干扰的T_1转基因植株测定并分析株高、穗长、叶夹角等农艺性状的变化和萌发初期的根长、胚芽鞘长度的变化以及对芸苔甾内酯(BL)的响应程度。结果表明，OE-OsBAK1P转基因水稻植株株高矮化，穗长变短，叶片夹角下降，种子萌发后根长增长而幼苗长度缩短，叶片对BL的响应不敏感；而RNAi-OsBAK1P转基因水稻植株株高增加，穗长变长，叶片夹角增加，种子萌发后根长缩短而幼苗长度增长，叶片对BL的响应敏感。综上，这些结果为改变水稻植株结构进而增加籽粒产量提供理论支持并可能为后续研究OsBAK1和前体物质OsBAK1P的其他功能提供参考。
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
欧阳乐军 梁卓玲 黄真池 沙月娥 曾富华
【目的】构建aiiA基因的原核表达载体，并进行诱导表达，检测aiiA蛋白的抗病性，为进一步通过转基因技术培育转aiiA基因植株奠定基础。【方法】 从pMD-TM-19-T Vector＋aiiA质粒中酶切获得aiiA基因，将其与pGEX-4T-1表达载体连接构建重组原核表达载体pGEX-4T-1＋aiiA，经双酶切及测序鉴定后，进行诱导表达，并对表达产物的功能进行鉴定。【结果】双酶切与PCR检测结果表明，重组原核表达载体pGEX-4T-1＋aiiA构建成功。表达条件优化结果表明，在25 ℃下用0.2 mmol/L IPTG诱导9 h，aiiA蛋白的表达量最高。aiiA重组蛋白抑菌试验结果表明，...
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
欧阳乐军 梁卓玲 黄真池 沙月娥 曾富华
【目的】构建aiiA基因的原核表达载体,并进行诱导表达,检测aiiA蛋白的抗病性,为进一步通过转基因技术培育转aiiA基因植株奠定基础。【方法】从pMDTM19-T Vector+aiiA质粒中酶切获得aiiA基因,将其与pGEX-4T-1表达载体连接构建重组原核表达载体pGEX-4T-1+aiiA,经双酶切及测序鉴定后,进行诱导表达,并对表达产物的功能进行鉴定。【结果】双酶切与PCR检测结果表明,重组原核表达载体pGEX-4T-1+aiiA构建成功。表达条件优化结果表明,在25℃下用0.2mmol/L IPTG诱导9h,aiiA蛋白的表达量最高。aiiA重组蛋白抑菌试验结果表明,其能够降解细...
[期刊] 中国农业科学
[作者]
李军 吕长荣 窦琳 窦忠英
【目的】构建小鼠Nanog基因原核表达载体并进行表达,以期得到大量GST融合蛋白。【方法】根据Gene Bank中的Nanog序列及pGEX-KG中的多克隆位点设计引物,以含有Nanog基因片段的pNA992重组质粒为模板,经PCR扩增出918 bp的DNA片段。将所得片段与pGEX-KG载体连接,转化TGⅠ大肠杆菌,筛选阳性克隆,其扩增片段测序结果与原序列一致,表明原核表达载体pGEX-KG-Nanog已构建成功。提取pGEX-KG-Nanog质粒转化到BL21(DE3)表达菌株中,经IPTG诱导后收集菌体进行SDS-PAGE电泳鉴定,并优化其表达条件。【结果】在大肠杆菌中获得Nanog基因...
[期刊] 华北农学报
[作者]
西廷业 王洪刚 后猛 刘海燕 刘树兵
以植物双元表达载体pCAMBIA2300-35为基础,设计带有酶切位点KpnI和XbaI的一对引物,从克隆载体pGEM-NCED1扩增到目的基因TaNCED1,酶切回收后与同样双酶切的表达载体pCAMBIA2300-35连接,获得表达载体pTaNCED1,并将所构建的载体导入根癌农杆菌GV3101菌株,为该基因的功能鉴定及通过基因工程的方法提高小麦的抗逆性奠定了基础。
[期刊] 中国水产科学
[作者]
邓思平 陈松林
在脊椎动物中,许多基因参与了性腺的分化和性别的决定过程,Doublesex and mab-3-related transcription factor1(Dmrt1)编码了一个具有DM框的转录因子,在哺乳类、鸟类、两栖类、爬行类和鱼类中与雄性性腺的分化和形成有关,是一种目前已知从无脊椎动物到人最保守的性别分化相关基因。半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)是近年来新开发的一种理想的增养殖对象,雌性个体生长速度比雄性快2~3倍,为了探索半滑舌鳎的性别决定机理,培育全雌苗种,实现单性养殖,本研究采用同源克隆策略,从半滑舌鳎精巢中获得Dmrt1α cDNA全长1149bp,其中包...
关键词：
半滑舌鳎 Dmrt1α cDNA 克隆
[期刊] 华中农业大学学报
[作者]
李林 梁宏伟 李忠 罗相忠 张志伟 朱媛媛 邹桂伟
利用RT-PCR和cDNA末端快速扩增技术(rapid amplification of cDNA ends,RACE)克隆了黄颡鱼DMRT1基因cDNA全长序列,并利用实时荧光定量RT-PCR技术对该基因在黄颡鱼成体不同组织及不同发育阶段的表达情况进行研究。结果表明,黄颡鱼DMRT1基因cDNA序列全长1 381bp,其中5′端非翻译区30bp,3′端非翻译区454bp[不包括poly(A)],开放阅读框885bp,编码295个氨基酸。氨基酸序列同源性分析表明,黄颡鱼DMRT1基因与革胡子鲶同源性最高(为81%),与黑鲷、虹鳟、斑马鱼、青鳉的同源性分别为60%、59%、64%和52%,与小鼠...
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