基于1DE的nanoLC-MS/MS方法分析毛白杨次生维管系统的蛋白质组,成功鉴定:14个蛋白质参与细胞分裂,7个转录因子,22个与细胞骨架相关蛋白质,31个与细胞信号转导相关蛋白质,14个与细胞壁相关蛋白质。显示这些蛋白质相应基因参与形成层活动的调控,为进一步了解木材形成的分子机制奠定基础。

【目的】次生维管系统再生能够在树干维管系统丧失后通过去分化、再分化或转分化等组织修复手段实现维管组织的再生。为了鉴定和研究次生维管系统发育相关的重要基因和调控元件,本文利用毛白杨次生维管再生系统,分析了不同再生时期的基因表达模式,为进一步揭示木材形成的基因调控机制奠定基础。【方法】将4年生毛白杨无性系在形成层活动旺盛期进行环剥取样。对剥皮后的树皮内侧和树干表面的样本,以及再生第7、10、14、18和21天5个不同时期获取的再生材料进行高通量转录组分析,并利用基因共表达分析(WGCNA)方法,得到与不同再生时期密切相关的模块,并对这些特异表达的基因进行表达网络和生物学功能分析。【结果】将第0天(剥皮当天)树皮内侧样本与树干表面样本、再生第7天样本与树干表面样本,以及相邻再生时期的样本进行表达差异分析。对得到的14 202个差异基因进行WGCNA分析,构建基因共表达网络,获得与维管再生过程相关的10个共表达模块。其中,Grey60模块的基因在再生第7天样本和树皮内侧样本中特异表达,主要涉及DNA复制、有丝分裂、细胞分裂和微管运动等功能;该模块还含有大量与表观遗传调控、细胞周期相关的基因,它们在再生第7天的高表达可能激活了脱分化木质部细胞的增殖和组织类型的改变,使其获得再分化能力。此外,Pink模块的基因在第0天成熟维管组织样本中的表达量极低,但在再生过程中表达呈上升趋势,到第21天达到最高值;这些基因主要参与细胞分裂、细胞壁修饰、韧皮部发育、碳水化合物代谢、DNA的转录调控等相关的生物学途径。Pink模块中与韧皮部分化相关的标记基因,比如APL、NAC45/86、DOF、BSPA、PP2和SUS的表达被重新激活,与调节形成层细胞增殖和分化的CLE41/44和CLV1一样,表达量都是从再生第10天开始逐渐增加。到次生维管系统再生后期的第18天和第21天,形成层已经完成了结构重构并能进行细胞的分裂、分化,此时木质部标记基因和次生壁调控因子有较高的表达。【结论】毛白杨次生维管系统再生早期,脱分化的木质部细胞通过表观遗传和细胞周期调控重新获得细胞分生能力;之后,韧皮部的细胞分化程序被启动,再生形成层开始细胞增殖和分化;到再生后期,通过相关基因调控,形成层再分化木质部和韧皮部。通过对次生维管组织再生过程中基因的表达分析和调控模块的鉴定,进一步验证了次生维管再生的遗传调控基础,也可为揭示植物维管组织再生的调控机制奠定基础。

本实验以毛白杨芽为实验材料,采用Tris-酚法、三氯乙酸-丙酮法和三氯乙酸-丙酮+Tris-酚法对其蛋白质提取方法进行比较,采用双向电泳分离蛋白质,通过PDQuest软件和质谱对这3种提取方法得到的双向电泳胶进行分析。结果显示,三氯乙酸-丙酮法得到的蛋白点数量为231±4,得到的鲜样中的总蛋白质含量为(3.57±0.618)mg/g,均高于其他两种提取方法,并且所得到的双向电泳胶更清晰,为毛白杨芽蛋白质提取的最适方法。

组蛋白去乙酰化酶HDAC具有调节细胞增殖、诱导细胞分化、凋亡的作用,是近年生物学研究热点之一,而在木本植物方面的作用却鲜有报道。【目的】本实验用组蛋白去乙酰化酶抑制剂曲古抑菌素A(Trichostatin A,TSA)对杨树悬浮细胞进行处理,通过改变细胞的组蛋白乙酰化水平,来探讨其对基因表达谱变化的影响。【方法】用0.5μmol/L的TSA处理悬浮细胞,10 d后收集材料用于RNA-Seq分析,比较经过TSA处理与对照组的悬浮细胞之间转录组表达差异情况。【结果】通过显微镜观察发现,对照组细胞呈均匀椭圆形,而经过TSA处理后的细胞出现圆形及长条形细胞。通过转录组分析得到4 465个差异表达基因(DEGs),其中2 363个基因上调,2 102个基因下调。差异表达基因主要富集在细胞周期、苯丙素生物合成、细胞壁结构成分和乙酰化相关等途径。【结论】通过分析TSA处理和对照组的悬浮细胞基因表达差异,发现TSA通过影响组蛋白乙酰化水平直接或间接影响细胞生长、细胞壁组分和细胞周期的相关基因,为认识组蛋白乙酰化对植物生长发育的影响提供依据。

以甘蔗品种ROC22为材料,采用含100 g/L聚乙二醇(PEG)6000的Hoagland营养液模拟干旱胁迫处理,SDS-PAGE电泳技术分析干旱胁迫对甘蔗幼苗根系蛋白质的影响。结果表明:与对照相比,24 h胁迫过程中稳定存在的新增蛋白条带为44.5 ku,可能是应答干旱胁迫的主要新增调节蛋白;57.1和29.0 ku蛋白条带在24 h处理期间相对表达量变化活跃,胁迫初期57.1 ku蛋白条带显著增加,29.0 ku蛋白条带显著下降,胁迫过程中出现起伏变化;而62.7、40.4与48.2 ku蛋白条带在PEG胁迫早期相当长时间保持稳定,后期才出现显著增加与下降;PEG胁迫14 h处理蛋白质条...

小麦是人类的主要粮食作物之一。硫化氢（Ｈ２Ｓ）被认为是细胞内第３种气体信号分子，关于Ｈ２Ｓ对植物的调控机理的研究越来越多，主要集中在参与植物形态建成，调节生理生化活动，应答非生物胁迫，应答生物胁迫４个方面，但外源Ｈ２Ｓ对小麦根系生理生化及蛋白质表达调控作用机制的研究鲜有少见，研究其具有重要意义。采用硫氢化钠作为硫化氢的外源性供体，研究不同浓度硫氢化钠（０，０．０５，０．１０，０．２０，０．４０，０．８０，１．６０，３．２０ ｍｍｏｌ／ｌ）对小麦根蛋白质差异表达谱的影响，以探寻Ｈ２Ｓ对小麦幼苗生长发育的机制。通过对小麦根部的比较蛋白质组学分析发现，不同浓度的硫氢化钠处理引起了涉及光合作用、糖代谢．．．

【目的】探讨家蚕杂交育成品种及其亲本蛋白水平的差异,从蛋白水平分析育成品种的基因结构,为阐明杂交育种成败的分子机理创造条件。【方法】采用蛋白质组研究技术,分析杂交亲本及其育成品种的丝腺、血淋巴和中肠的蛋白质表达谱。【结果】3种组织器官中育成品种金秋与两个亲本的匹配蛋白斑点比例只达到70%左右,剩余30%左右是各个品种的特异蛋白斑点;在匹配蛋白斑点中,还有9%～24%的蛋白表现上调和下调。这些特异蛋白可能是两个亲本的基因在杂交育成品种中产生了互作而形成的新蛋白,也可能是对相同的蛋白进行了不同的修饰而获得的修饰蛋白。【结论】新品种的育成,除了汇集亲本的优良基因外,还有赖于基因互作产生的新功能蛋白的...

【目的】二维液相色谱(2D-LC)与双向电泳(2-DE)技术具有互补性,本文旨在探讨利用2D-LC和纳升级液相色谱串联质谱(Nano LC-MS/MS)技术分离鉴定小麦叶片蛋白质组的新方法。【方法】小麦叶片蛋白经提取、脱盐后,进行第一维阴离子交换分离;收集洗脱组分进行SDS-PAGE分析,并对非高丰度蛋白组分进行第二维反相液相色谱分离;随机选择含较低吸收峰的部分组分经胰蛋白酶水解后进行Nano LC-MS/MS分析;将串联质谱数据通过MASCOT搜索NCBInr和EST数据库,并对二级质谱获得的蛋白序列进行MSBLAST分析。【结果】经第一维阴离子交换色谱分离,收集得到15个组分,其中第15组...

【目的】为了研究刚毛柽柳响应盐胁迫的作用机制,本研究以刚毛柽柳叶片为材料,对叶片总蛋白质的提取方法进行优化,探究出适用于双向电泳的刚毛柽柳叶片总蛋白质的提取方法,并建立NaHCO_3胁迫下刚毛柽柳叶片差异蛋白质的表达谱。【方法】本研究比较了改良Tris-三氯乙酸,改良Tris-三氯乙酸+PVP40,改良Tris-三氯乙酸+丙酮和植物蛋白提取试剂盒法4种提取植物蛋白质的方法提取刚毛柽柳叶片总蛋白质的差异,并利用蛋白质双向电泳用技术研究NaHCO_3胁迫后刚毛柽柳叶片蛋白质表达变化,建立了盐胁迫下刚毛柽柳叶片差异蛋白表达谱。【结果】采用改良Tris-三氯乙酸法提取刚毛柽柳叶片蛋白质,利用该方法可获得高质量的蛋白质样品,所得到的双向电泳凝胶图谱中蛋白质分离效果好、图谱分辨率高,通过Image Master 2D Platinum 7.0凝胶分析软件对NaHCO_3处理0和12 h的双向电泳凝胶图谱进行分析,获得了25个响应盐胁迫的差异表达蛋白质,并分析了差异表达蛋白量的变化。【结论】研究结果表明,利用改良Tris-三氯乙酸法提取刚毛柽柳叶片蛋白质适用于双向电泳体系,该方法可以用于对刚毛柽柳叶片蛋白质组学的研究。本研究建立了NaHCO_3胁迫下刚毛柽柳叶片差异蛋白质的表达谱,为进一步分析刚毛柽柳耐盐分子机制奠定了基础。

【目的】构建一种可获得Sumo修饰蛋白的原核表达系统,为Sumo化修饰蛋白的批量制备奠定基础。【方法】用Trizol裂解法提取小鼠畸胎瘤细胞F9的总RNA,反转录成cDNA后PCR扩增获得Sumo1、Ubc9、Sae2和Sae1基因。将上述基因及相应载体酶切、连接后构建出重组质粒pACYC-Ubc9-Sumo1、pCDF-Sae2-Sae1。采用质粒转化-制备阳性克隆感受态细胞-质粒转化的方法获得pACYC-Ubc9-Sumo1和pCDF-Sae2-Sae1共表达的Su-mo化修饰的原核表达系统。以pGEX-GST-Sox2和pGEX-GST-Sox2K247R重组质粒为例,采用Western...

从毛白杨(Populus tomentosa)木质化茎中提取总RNA,利用RT-PCR技术进行cDNA扩增,获得1条1 621 bp的片段。测序结果表明:该片段编码536个氨基酸组成的多肽,序列中包含所有已知4-CL蛋白的2个特征序列boxⅠ(SSGTTGLPKGV)和boxⅡ(GEICIRG)。将cDNA克隆到原核表达载体pET-32a(+)中,并转化大肠杆菌(Escherichia coli)感受态细胞BL21(DE3)。IPTG诱导后,经SDS-PAGE和Western-blot分析表明,4-CL基因在大肠杆菌BL21中获得表达,所表达融合蛋白的分子量约为70 ku。酶活性分析表明:该重...

［目的］烟草具有典型的次生维管发育过程，为了阐明烟草可用于次生维管发育相关基因功能的研究，［方法］通过高通量测序技术获得了烟草维管组织发育的相关ＭＹＢ转录因子，比对毛白杨基因组数据库，得到烟草和杨树的直系同源基因。利用烟草和毛白杨的基因表达谱，分析了ＭＹＢ基因表达量变化，并进一步采用荧光定量ＰＣＲ进行了不同组织的表达分析。［结果］分析得到４８对烟草和毛白杨的ＭＹＢ直系同源基因，可分为２３个亚组。１５对ＭＹＢ同源基因在烟草和毛白杨中的表达模式相似。［结论］可以利用烟草所建立的快速基因鉴定系统分析ＭＹＢ转录因子在维管发育过程中的调控作用。

组合利用生物信息学和RT-PCR方法,首次从毛白杨未成熟木质部cDNA中分离出PtCesA4cDNA全长,并进行测序和序列分析,结果表明克隆的毛白杨PtCesA4 cDNA片段总长为3757bp,基因内部含有完整的开放阅读框架,大小为3129bp,可编码长度为1042个氨基酸残基的蛋白质,所推导的蛋白质氨基酸序列与拟南芥AtCesA4、水稻OsCesA1和火炬松PtCesA2的蛋白质氨基酸序列同源性分别为80.3%,78.9%和75.6%。组织特异性Realtime-PCR结果显示,PtCesA4基因在杨树根、茎、叶片和顶端分生组织中均有表达,但其表达模式却不同:PtCesA4在成熟叶片、未成...

【目的】研究自然环境条件下剪叶和油松毛虫不同取食刺激程度双重诱导对油松体内蛋白质表达的影响，揭示油松诱导防御反应的蛋白质基础。【方法】在河北省平泉县的油松－山杏混交林中，选取１５年生左右生长势一致的油松，进行树上套笼饲养１０头、３０头油松毛虫和剪叶处理，以未处理油松为对照，采用双向电泳法测定油松体内蛋白质表达差异。【结果】通过蛋白质点表达量的计算，与对照相比，油松毛虫取食及剪叶刺激后，均有特异表达蛋白点、消失蛋白点、上调蛋白点及下调蛋白点，但不同处理间蛋白点的表达差异不同。对差异蛋白点进行质谱鉴定，数据库检索结果表明，油松毛虫取食后特异表达的蛋白点是叶绿体ＡＴＰ合酶ＣＦ０β亚基、抗坏血酸过氧化．．．

【目的】YABBY是高等植物中特有的转录因子家族,在侧生器官发育和开花过程中发挥重要作用。本研究对毛白杨PtYABBY基因进行克隆和生物信息学分析,并对雌雄花芽8个关键发育时期和根茎叶等组织中PtYABBY基因表达模式进行探究,以期为阐明PtYABBY基因在毛白杨侧生器官发育过程中的功能奠定前期基础。【方法】以毛白杨为试材,采用同源基因克隆法从毛白杨中分离FILAMENTOUS FLOWER (FIL)/YABBY3 (YAB3)同源基因PtYABBY3、PtYABBY4和PtYABBY11的编码区序列,并开展生物信息学分析。通过qRT-PCR研究这3个基因在雌雄花芽8个发育时期及根、茎、幼叶、成熟叶片中的表达规律。【结果】PtYABBY3、PtYABBY4和PtYABBY11编码区长度分别为633、642、639 bp,分别编码210、213、212个氨基酸。所推测的氨基酸序列包含C_2C_2锌指结构域和YABBY结构域。系统进化分析进一步表明这3个基因属于FIL/YAB3亚家族成员。qRT-PCR结果显示这3个基因在根、茎、叶及8个时期雌雄花芽组织中均有表达,但PtYABBY基因间的表达水平存在明显差异。PtYABBY3表达水平在雌雄花芽发育初期下调,发育后期上调;花原基形成到休眠期内PtYABBY3在雌雄花芽中呈现相反的表达变化趋势。PtYABBY4和PtYABBY11基因在雌雄株成花诱导期表达水平最高,成花诱导到伸长期内呈现下降趋势,在雄花芽休眠期和小孢子发生期基因表达水平无明显变化。营养组织表达量测定结果显示这3个基因在幼叶和成熟叶片中表达水平相对较高,根系中表达量最低。【结论】YABBY基因家族成员PtYABBY3、PtYABBY4和PtYABBY11同属FIL/YAB3亚类,在毛白杨雌雄花芽发育的8个时期中表达水平存在较大差异,且在叶片和花芽中表达量较高,表明其可能与叶片和花芽发育相关。本研究为今后深入研究YABBY家族成员在杨树器官生长发育过程中的作用奠定基础。