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[期刊] 华中农业大学学报
[作者]
赵娜 王安华 何玉龙 聂芬 袁芳艳 龙良启 刘平
利用猪传染性胸膜肺炎灭活菌苗免疫日本大耳兔得到猪传染性胸膜肺炎抗血清,将血清用饱和硫酸铵粗提IgG后,经DEAE-sephadex-A50低压层析系统纯化,以此得到IgG作为配基包被酶标板,对噬菌体随机十二肽库进行3轮不同条件的富集筛选,通过改变筛选条件,噬菌体的回收率从5.76×10-5增加到了1.69×10-2,P/N值逐步提高;随机挑取10个噬菌斑进行扩增,用ELISA检测其免疫活性,结果有6个阳性克隆与纯化的IgG有较强的特异性结合能力;对筛选到的6个阳性克隆提取ssDNA进行测序,并分析其氨基酸序列,其中5个克隆所递呈的序列一致,用Blastp软件进行分析,2种类型的氨基酸序列之间无...
[期刊] 华中农业大学学报
[作者]
袁芳艳 何玉龙 赵娜 聂芬 伍晓雄 龙良启 李奎 罗晓松
用生长抑素(somatostatin,SS)疫苗“激生1号”免疫日本大耳兔得到抗血清,经饱和硫酸铵粗提IgG,再经DEAE-sephadex-A50低压层析系统纯化后,以此IgG作为筛选配基,对随机十二肽库进行4轮淘洗。随机挑取22个噬菌斑进行双夹心ELISA,结果有6个克隆与SS抗体有较强的特异性结合力,竞争抑制ELISA进一步证明6个克隆有较好的抑制作用。将6个阳性克隆提取ssDNA进行测序,测序结果中有5个克隆的外源肽序列完全一致,经与SS氨基酸序列比对,发现两者有共同序列FWK,说明5个克隆模拟了生长抑素的抗原表位。
关键词：
生长抑素 噬菌体随机肽库 模拟表位
[期刊] 中国农业科学
[作者]
王妍入 李培武 张奇 丁小霞 张文
【目的】笔者实验室前期免疫并构建噬菌体展示纳米抗体库,应用此抗体库筛选、制备可以用作黄曲霉毒素无毒替代抗原的纳米抗体。本研究旨在探明已筛选出的噬菌体展示纳米抗体Phage 2-5用作黄曲霉毒素替代抗原的活性,为后续纳米抗体的合成以及黄曲霉毒素绿色免疫分析方法的建立奠定基础。【方法】前期,笔者实验室对羊驼免疫黄曲霉毒素抗原(AFB1-BSA),经过5次免疫后,取血,提取RNA,反转录为cDNA,并采用PCR技术对抗体可变区VHH区域进行扩增,与载体pComb3X偶联,构建噬菌体展示纳米抗体库;经过吸附-洗脱的淘选过程筛选出能够与黄曲霉毒素竞争结合抗黄曲霉毒素单克隆抗体1C11的噬菌体展示纳米抗体...
关键词：
黄曲霉毒素 模拟抗原 噬菌体展示纳米抗体
[期刊] 中国农业科学
[作者]
辛九庆 高玉龙 李媛 王砚范 钱爱东
目的丝状支原体丝状亚种SC(MycoplasmamycoidessubspmycoidesSC,MmmSC)是引起牛传染性胸膜肺炎(contagiousbovinepleuropneumonia,CBPP)的病原体。成熟的脂蛋白LppQN端是亲水性的,在自然感染和人工感染时,特异性免疫反应产生早,持续时间长,抗体滴度高,因此有理由相信脂蛋白LppQN端片段将有可能成为一种理想的CBPP诊断抗原。方法由于TGA密码子在支原体中编码色氨酸(Trp),而在细菌中则为终止密码子,故利用一步重叠延伸PCR突变方法体外诱变中国生产抗原用毒株HVRIⅩ的lppQ基因进行原核表达,利用重组抗原建立间接ELIS...
[期刊] 中国农业科学
[作者]
苗向阳 丁淑燕 朱玉良 郝慧芳 邵建军
用猪脂肪细胞以免疫删减法免疫小鼠,取其脾细胞,RT-PCR扩增抗体重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)基因,克隆入噬菌粒表达载体pCANTAB5E中,构建单链抗体(ScFv)文库。用猪脂肪细胞,对其进行3轮吸附-洗脱-富集,筛选抗猪脂肪细胞膜单抗。经ELISA检测,51/96克隆具有与猪脂肪细胞结合活性,阳性率为53%,与猪肝细胞则成阴性反应,初步证明了单抗的特异性,为猪脂肪细胞膜单抗的制备提供了一种新的方法。
关键词：
单链抗体 噬菌体抗体库技术 猪脂肪细胞
[期刊] 中国农业大学学报
[作者]
孔祥宇 杨文静 庞申雨 苑庆欣 潘顺圆 高东阳 宋军 王金涛
为探究噬菌体作为新型生物抗菌剂防控肺炎克雷伯菌引起的奶牛乳房炎和乳制品及其加工过程污染，以及对生物被膜清除的能力，以ATCC 700603为宿主菌从某牛场水样中分离得到1株肺炎克雷伯菌噬菌体vB＿KpnM-YP11，并通过透射电镜观察噬菌体形态特征；通过双层平板法测定噬菌体宿主谱；通过最佳感染复数、一步生长曲线、温度和pH稳定性测定噬菌体生物学特性；通过全基因组测序分析基因组的结构特征、比较其进化关系；通过结晶紫染色法和平板计数法测定噬菌体对生物被膜的抑制和清除效果；通过牛奶试验分析该噬菌体对牛奶中肺炎克雷伯菌的抑菌效果。结果表明：1）从牛场水样中分离获得肺炎克雷伯菌噬菌体vB＿KpnM-YP11，能形成清晰透亮噬菌斑，透射电镜观察vB＿KpnM-YP11具有肌尾噬菌体的典型结构。2）测定噬菌体宿主谱，表明vB＿KpnM-YP11能够裂解18/34株牛源肺炎克雷伯菌。3）生物学特性结果表明vB＿KpnM-YP11最佳感染复数为0.1,vB＿KpnM-YP11感染宿主菌潜伏期为30 min，爆发期为50～90 min,110 min后进入平台期，平均裂解量为69PFU/cell，在pH(3～11)和温度（4～60℃）范围内活性稳定。4)vB＿KpnM-YP11基因组全长166 607 bp,GC含量为39.52%，注释结果显示共有276个ORF和15个tRNA，不含耐药基因及毒力基因。5)vB＿KpnM-YP11最佳感染复数为0.1时，具有显著抑制肺炎克雷伯菌生物被膜的形成能力。vB＿KpnM-YP11效价为10～8 PFU/mL,10～9 PFU/mL能有效清除肺炎克雷伯菌生物被膜。在室温条件下，12 h内vB＿KpnM-YP11使牛奶中细菌浓度下降98%。综上，本研究分离获得噬菌体vB＿KpnM-YP11潜伏期短、裂解效率高，不仅能抑制和清除生物被膜，同时对牛奶中肺炎克雷伯菌也有显著的抑菌效果，具有作为肺炎克雷伯菌生物抗菌剂的应用潜力。
[期刊] 华中农业大学学报
[作者]
陈凡 何启盖 陈焕春 吴斌 刘正飞 Ross Bowle Pat Blackall
利用14个血清型的胸膜肺炎放线杆菌的标准菌株制备诊断抗原,通过玻片凝集试验,琼脂扩散试验和对流免疫电泳,以标准抗血清作为参考,检验各种诊断抗原的灵敏性和特异性。分别用凝集抗原、超声波处理抗原和酚水抗原对来自湖北、湖南、江西、河南、安徽5省猪场的155份送检血清进行检测。结果表明可以对送检血清快速、准确地进行鉴别诊断和血清分型。
关键词：
胸膜肺炎放线杆菌 诊断抗原 血清分型
[期刊] 中国农业科学
[作者]
邵美丽 刘思国 王春来 王勇 宫强 尹训南 郭设平 刘建东 佟恒敏
【目的】欲构建具有较好交叉免疫保护效果的多组分重组亚单位疫苗,从而为猪传染性胸膜肺炎新型疫苗的研制提供参考。【方法】利用分子克隆和重组表达技术获得了猪传染性胸膜肺炎放线杆菌6种主要毒力因子rApxⅠ、rApxⅡ、rApxⅢ、rApxⅣ、rApfa和rOMP。并设立以灭活苗(5×108cfu)为试验Ⅰ组,以重组蛋白rApxⅠ、rApxⅡ、rApxⅢ和rOMP为试验Ⅱ组,以rApxⅠ、rApxⅡ、rApxⅢ、rApxⅣ、rApfa和rOMP为试验Ⅲ组,以PBS为空白对照组。分3次免疫BALB/c小鼠,每次间隔2周,第3次免疫后的第7天以APP1型(5×109cfu)和APP2型(5×1010cfu...
[期刊] 西南农业学报
[作者]
邹明 曾振灵
采用二倍稀释法测定了麻保沙星等对猪胸膜肺炎放线杆菌的体外抑菌作用,然后对人工感染胸膜肺炎放线杆菌的猪进行临床治疗试验。猪人工发病4 h后,分别以1.25、2.5、5 mg/kg体重的剂量肌注给药麻保沙星(每组10头),1 d 1次,连续4 d。结果表明:麻保沙星对胸膜肺炎放线杆菌的最小抑菌浓度为0.01μg/mL;对猪传染性胸膜肺炎,麻保沙星(2.5、5 mg/kg)有显著疗效,治愈率分别为80%及90%。
关键词：
麻保沙星 传染性胸膜肺炎 药效学 猪
[期刊] 水产学报
[作者]
章晋勇 吴英松 汪建国
Phage display antibody library has been proven to be a powerful technique used in development of antibodies. Since it was established in 1990, the technology has made enormous improvement and played more and more important role in basic research of biology, immunology, oncology, protein engineering,...
关键词：
噬菌体抗体库 应用 前景 水产养殖
[期刊] 中国农业大学学报
[作者]
孔梓安 宋想胜 程如楠 甄思慧 吴竹青 吴清民 王真
为筛选牛病毒性腹泻-黏膜病病毒（Bovine viral diarrhea virus,BVDV）gP48蛋白的单链抗体，本研究利用噬菌体展示技术构建了gP48蛋白单链抗体克隆文库，通过微孔筛选法对抗体库进行3轮富集淘筛，利用ELISA技术测定单链抗体的亲和力，对亲和力较高的克隆进行基因测序分析和结合活性测定，旨在获得gP48蛋白的单链抗体。结果表明：1）成功构建了库容量为4.3×107的噬菌体单链抗体库，其重组率为83.3%，经三轮筛选对噬菌体抗体库进行富集，富集倍数为1.43×104;2）优化了间接ELISA方法，筛选到3株与BVDV gP48蛋白具有高亲和力的单链抗体以及其基因序列，通过IgBLAST分析显示，3株单链抗体均为鼠源IgG。综上，从gP48蛋白的单链抗体库中筛选获得3个具有高亲和力的单链抗体，可用于后续BVDV检测方法的建立。
[期刊] 中国农业科学
[作者]
苗向阳 邵建军 朱瑞良 王建民
【目的】构建单链抗体(ScFv)噬菌体表面展示文库,从中筛选抗羊抑制素单抗并进行表达,建立制备羊抑制素单抗的新方法。【方法】用未经免疫的多种小鼠脾细胞作为基因来源,采用噬菌体抗体库技术,构建天然噬菌体表面抗体文库。用羊抑制素对其进行3轮吸附-洗脱-富集,筛选抗羊抑制素单抗,用ELISA检测其抗原结合活性。【结果】构建了天然鼠源噬菌体抗体库,为筛选和制备各种单链抗体提供了一个平台。用羊抑制素对其进行筛选,制备抗羊抑制素单抗,经ELISA检测,55/96克隆具有与羊抑制素结合活性,阳性率为57%。【结论】制备的羊抑制素可溶性ScFv及其表面展示噬菌体抗体有很好的抗原结合活性,为羊抑制素单抗的制备提...
关键词：
噬菌体抗体库 单链抗体 羊
[期刊] 华中农业大学学报
[作者]
刘军发 何启盖 陈焕春 吴斌 逯忠新 曹胜波 徐引弟 王革非 刘正飞
为了快速诊断猪的传染性胸膜肺炎 ,试验设计合成了 1对引物 ,建立了检测猪胸膜肺炎放线杆菌的PCR方法。猪胸膜肺炎放线杆菌Ⅰ型菌血清 2、5、6、9、10型均能扩增出预期片段 ;大肠杆菌、猪痢疾蛇形螺旋体、多杀性巴氏杆菌、鸡葡萄球菌和支气管败血性波氏杆菌的扩增结果均为阴性。用该方法检测了自猪肺脏分离的30个菌株 ,有 11株为阳性 ,19株为阴性。结果证实 ,本方法可以用于猪胸膜肺炎的快速诊断
关键词：
猪胸膜肺炎放线杆菌 检测 聚合酶链式反应
[期刊] 中国农业大学学报
[作者]
温凯 沈建忠 孟辉 吴聪明 王战辉 张素霞
本研究以兽药恩诺沙星为对象,构建噬菌体抗体库,为低成本、快速制备目的抗体提供新的途径。以恩诺沙星-鸡卵清蛋白(ENR-OVA)为免疫原对Balb/c小鼠进行免疫,取其脾细胞提取总RNA,并分别扩增全套抗体轻、重链基因,通过重叠延伸PCR技术,以编码柔性多肽(Gly3Ser)4的基因为接头,将轻重链基因组装为完整的scFv基因,将之克隆入pCANTAB5E载体,转化大肠杆菌XL1-Blue,以辅助噬菌体M13KO7对其进行超感染,构建噬菌体抗体库并进行富集、筛选和鉴定;构建了库容量约为2.2×106的抗恩诺沙星噬菌体单链抗体库,并筛选出26株阳性克隆,为表达单链抗体、建立免疫检测方法奠定基础。
[期刊] 林业科学研究
[作者]
陈敏 张志毅 卢孟柱
本文综述了噬菌体展示技术的研究现状和发展趋势 ,着重描述了噬菌体展示技术的筛选方法及其在生命科学研究领域的广泛应用 ,结合目前我国天牛防治存在的问题 ,分析了噬菌体展示技术在天牛防治技术研究中的应用潜力
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噬菌体展示 天牛 防治方法
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