[目的]本文主要探究干扰素基因刺激因子（Stimulator of interferon gene，STING）对金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，S. aureus）感染引起线粒体功能障碍的影响，为S. aureus引起的乳腺炎的防控提供理论支撑。[方法]以小鼠乳腺上皮细胞系（EpH4-Ev）、S. aureus（ATCC 29213）为研究对象，细胞试验分为对照组（Control、STING抑制剂C-176单独处理和线粒体分裂抑制剂Mdivi-1单独处理）、感染组（S. aureus）、处理组（C-176+S. aureus和Mdivi-1+S. aureus）。分别检测乳腺上皮细胞中STING通路的激活、线粒体功能相关蛋白的表达水平、线粒体DNA（mtDNA）拷贝数、线粒体活性氧（mROS）水平和线粒体膜电位（MMP）以及线粒体形态的变化等。动物试验分为对照组（C57BL/6野生型WT小鼠和C57BL/6 STING基因敲除STING KO小鼠）、感染组（WT+S. aureus和STING KO+S. aureus），分别检测肝脏组织和乳腺组织中的总抗氧化能力（Total antioxidant capacity，T-AOC）、N-乙酰β-D-氨基葡萄糖苷酶（N-Acetyl Beta-D-Glucosaminidase，NAGase）和丙二醛（Malondialdehyde，MDA）等生化指标。[结果]S. aureus感染乳腺上皮细胞导致STING通路激活，线粒体动力相关蛋白1（Dynamin-related protein 1，Drp1）Ser616位点磷酸化水平升高（P<0.05），线粒体融合蛋白1（Mitofusion 1，Mfn1）和线粒体融合蛋白2（Mitofusion 2，Mfn2）表达量降低（P<0.05），C-176和Mdivi-1处理均降低了Drp1 Ser616的磷酸化水平（P<0.01），恢复了Mfn1和Mfn2的表达量（P<0.05），缓解S. aureus引起的线粒体碎片化。同时，C-176和Mdivi-1处理均显著抑制S. aureus感染诱导的乳腺上皮细胞中mROS水平升高和MMP的异常下降（P<0.05），以及mtDNA拷贝数的下降（P<0.05）。此外，缺失STING基因可以恢复S. aureus感染引起的小鼠肝脏和乳腺中T-AOC水平（P<0.01），降低NAGase活性与MDA含量（P<0.05）。[结论]抑制STING可以改善S. aureus感染乳腺上皮细胞诱导的线粒体功能障碍，缺失STING基因可以缓解S. aureus感染引起小鼠肝脏和乳腺的组织损伤和氧化应激。

[目的]研究苦参碱在金黄色葡萄球菌入侵奶牛乳腺上皮细胞(BMECs)过程中的干预作用及其原因,为苦参碱的临床应用奠定基础。[方法]用CCK-8法检测苦参碱对BMECs增殖的影响,用庆大霉素保护试验检测苦参碱对金黄色葡萄球菌入侵BMECs的影响;并在苦参碱干预金黄色葡萄球菌感染BMECs后,分别采用RTqPCR检测BMECs中抗菌肽基因的表达,Greiss法检测NO的分泌,Western blot检测NF-κB通路蛋白p65的表达。[结果] 25～100μg/mL苦参碱均能促进BMECs的增殖,并能抑制金黄色葡萄球菌入侵BMECs;苦参碱干预能显著下调BMECs中抗菌肽基因TAP和BNBD5 mRNA的表达,抑制NO的分泌和NF-κB的活化,并呈剂量依赖性。[结论]苦参碱通过抑制NF-κB的活化来抑制金黄色葡萄球菌入侵BMECs,并可显著下调金黄色葡萄球菌感染的BMECs中抗菌肽基因的表达。

【目的】研究大豆异黄酮(Soybean isoflavone,SI)的抑菌机制。【方法】本试验利用呼吸代谢抑制实验和4',6-二脒基-2-苯基吲哚(4',6-diamidino-2-phenylindole,DAPI)荧光染色对大豆异黄酮的抑菌机制进行研究。【结果】呼吸代谢抑制实验结果表明,当SI的终浓度为0.8mg·ml-1时,可显著抑制金黄色葡萄球菌苹果酸脱氢酶的活性,SI组苹果酸脱氢酶的比活性与对照组相比降低了74.97%。DAPI染色结果显示,DAPI可以和金黄色葡萄球菌内的核酸结合,经过SI作用28h后,菌体内的核酸含量呈明显下降趋势,其中DNA的荧光强度减少了33.53%,RNA减...

目的利用PCR技术,无需增菌,直接检测乳品中的金黄色葡萄球菌。方法通过溶剂提取的方法从人工样品中提取模板,以金黄色葡萄球菌耐热核酸酶基因(nuc)为靶基因,经过PCR扩增得到279bp的产物。经过DNA测序证实该产物为目的扩增产物。采用PCR方法实际检测了乳品中的金黄色葡萄球菌,同时,与国标GB4789.10—94方法及两种快速检测致病性金黄色葡萄球菌测试片PetrifilmRSA.CountPlate及Baird-parker+RPFAgar进行了比较。结果PCR方法的灵敏度高,全脂乳和脱脂乳检测的检出限为10CFU/ml,奶酪检测的检出限为55CFU/g,可在6h内完成对乳品中金黄色葡萄球...

分别用透析法和DEAE离子交换层析法分离蜂王浆抗金黄色葡萄球菌肽.用透析法分离获得了分子质量≤3.5 ku、介于3.5 ku与12 ku之间以及≥12 ku的3种组分,测定结果显示分子质量≤3.5 ku和介于3.5 ku与12 ku之间的蜂王浆组分具有抗金黄色葡萄球菌的活性.用DEAE离子交换层析法分离了分子质量≤3.5 ku和介于3.5与12 ku之间的2种蜂王浆透析组分,其中分子质量≤3.5 ku的6个离子交换分离组分中,组分1和组分6具有抗金黄色葡萄球菌活性;分子质量介于3.5 ku与12 ku之间的6个离子交换分离组分中,组分1具有较强的抗金黄色葡萄球菌活性.

【目的】研究枯草芽孢杆菌素(Bacillus subtilis bacteriocin)Subticin112在体内外对金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)CVCC 1885的抑菌活性(bacteriostatic activity),为Subticin112的临床应用提供理论依据。【方法】体外抑菌:取相同有效质量的Subticin112、土霉素、青霉素、万古霉素、新霉素、链霉素和庆大霉素等分别溶于等体积的无菌生理盐水中,然后采用琼脂扩散法比较相同浓度的上述药物对金黄色葡萄球菌的抑菌活性。体内抑菌:将体重为18-22 g的SPF级KM雄鼠120只分成6组,分别为空白对照...

【目的】调查产生生物被膜的金黄色葡萄球菌流行病学特征，探究生物被膜形成能力与分子型之间的相关性，为治疗动物金黄色葡萄球菌感染提供理论依据。【方法】以广东省兽药研制与安全评价重点实验室保存的98株金黄色葡萄球菌为研究对象，用结晶紫半定量法测定所有菌株生物被膜形成能力，将产膜菌株进行22种常见抗菌药的最小抑菌浓度测定，通过金黄色葡萄球菌常见3种（spa、MLST和PFGE）分型方式进行分子分型，并分析产膜能力与分子型之间的相关性，最后通过全基因组测序技术分析生物被膜产生菌株中耐药基因和毒力基因携带状况。【结果】结晶紫半定量结果显示，98株金黄色葡萄球菌中能产生生物被膜的菌株共计23株，占23.47%。包括牛乳源22株（占比25.29%,22/87），其中14株（占比60.87%,14/22）来自浙江奶牛养殖场，8株（占比39.13%,8/22）来自福建奶牛养殖场，以及猪源1株（占比9.10%,1/11），来自广东屠宰场，说明牛乳源金黄色葡萄球菌产膜潜力高于猪源；将产膜能力划分为强、中、弱3个等级，23株产膜菌株中，其中强产膜菌株2株（占比8.70%,2/23），中产膜菌株9株（占比39.13%,9/23），以及弱产膜菌株12株（占比52.17%,12/23）。药敏试验显示，牛乳源产膜菌株对所有受试抗菌药物敏感，而猪源产膜菌株对青霉素、阿莫西林、头孢噻呋、头孢西丁、恩诺沙星、环丙沙星、克林霉素、多西环素、红霉素、氟苯尼考、复方新诺明、泰妙菌素、替米考星13种抗菌药均表现出耐药；spa分型结果显示，98株金黄色葡萄球菌共获得8种spa型，产膜的23株金黄色葡萄球菌占其中3种：1株t2922型来自广东猪源，14株t2119来自浙江牛乳源，8株t189来自福建牛乳源；MLST分型结果显示，98株菌共分为9种ST型，其中6种ST型不具有产生生物被膜的能力，分别为ST398、ST522、ST705、ST1651、ST479和ST151，仅3种ST型的菌株具有生物被膜产生能力，分别为ST9、ST7和ST188。结果表明，强产膜菌株分子型主要为ST7-t2119，中产膜菌株主要为ST7-t2119和ST188-t189，弱产膜菌株为ST9-t2922、ST7-t2119和ST188-t189；同时结合PCA分析不同ST型组间差异性发现，弱产膜菌株的ST型能与中强产膜菌株很好的区分开来，只有特定ST型的金黄色葡萄球菌才具有产生生物被膜的能力。23株产膜菌株PFGE分型全部成功，结果显示，广东、福建、浙江三省产膜菌株共分为3种PFGE型，且PFGE型存在地域分布特征，同一地区的分离株可能存在克隆传播，但克隆株之间生物被膜产生能力有明显差异；全基因组测序结果显示，产膜菌株中耐药基因和毒力基因根据分子型不同携带情况呈现多样性。【结论】不同来源的金黄色葡萄球菌有不同程度产生生物被膜的潜力，且均携带多种不同的产膜基因，牛乳源金黄色葡萄球菌产膜潜力远远高于猪源；菌株能否产膜与ST型存在强相关性，特定的ST型如ST9、ST7和ST188更容易产生生物被膜。

根据GenBank上发表的金黄色葡萄球菌β-溶血素基因序列,设计了一对特异性引物。提取临床乳腺炎致病性金黄色葡萄球菌山东株zfb的全基因组DNA为PCR模板,扩增β-溶血素基因,将PCR产物纯化后连接到pMD18-T载体中。测序结果表明,扩增片断含有993 bp的ORF,可编码含330个氨基酸和1个终止子的成熟蛋白,与已报道的金黄色葡萄球菌β-溶血素蛋白的氨基酸组成同源性为99.4%。软件分析显示,克隆的金葡菌β-溶血素是一种依赖于金属离子的磷脂酶。上述结果显示,已获得金黄色葡萄球菌β-溶血素基因,为获得重组金黄色葡萄球菌β-溶血素蛋白及对其结构和功能的研究奠定了基础。

【目的】研究食源性金黄色葡萄球菌各血清型肠毒素基因的分布,并进一步分析其时序性表达规律。【方法】针对51株各类食品中分离的金黄色葡萄球菌菌株,应用PCR技术对11种葡萄球菌肠毒素进行基因分型;提取细菌总RNA,以ftsZ和ropB作为内标基因,使用反转录荧光定量PCR研究各肠毒素基因在细菌生长周期中的表达水平变化。【结果】除see、ses和set外,其余8种肠毒素基因在51株食源性金黄色葡萄球菌菌株中均有检出,且sei和seg的检出率最高(27.45%)。各肠毒素基因在mRNA水平的时序性表达规律基本一致,均在对数后期达到峰值,随后快速下降。以内标基因为参照,同一菌株中不同肠毒素基因的相对表达...

采用微量肉汤稀释法、荧光共振能量转移试验和分子对接技术,分别探究毛兰素对金黄色葡萄球菌的体外抑制作用、对分选酶A(Srt A)的抑制作用及其作用的分子机制;通过构建小鼠腹膜炎模型,评价毛兰素对金葡菌腹膜炎的缓解作用。结果表明:毛兰素对金葡菌的体外最小抑菌质量浓度为512μg/m L,最小杀菌质量浓度大于1024μg/m L;毛兰素对SrtA活性有明显抑制作用,IC50为(20.91±2.31)μg/m L;毛兰素以紧凑的构象结合至SrtA的活性中心,与SrtA形成稳定的复合物来影响SrtA的生物活性;毛兰素对金葡菌引起的腹膜炎有良好的缓解作用,可减轻金葡菌所导致的小鼠脓肿症状。

为探究金黄色葡萄球菌超抗原样蛋白(Staphylococcal superantigen-like proteins,SSLs)与补体系统相关的生物学特征,利用原核表达系统表达SSL7重组蛋白,并通过补体杀伤试验、Western Blot以及Pull-down对其有关补体系统的生物学特征进行研究。结果表明:1)重组蛋白SSL7可在大肠杆菌感受态细胞BL21(DE3)系统中大量可溶性表达,大小约25ku;2)SSL7可阻断新鲜兔血清对大肠杆菌DH5α的补体杀伤作用;3)SSL7抑制补体激活后攻膜复合体(Membrane attack complex,MAC)的形成,新鲜兔血清无法在金黄色葡萄球菌NCTC 8325菌体表面形成MAC沉积;4)SSL7能捕获健康人血清(Human normal serum,HNS)中的补体C5,阻断补体系统的激活。综上,金黄色葡萄球菌超抗原样蛋白SSL7可以通过特异性结合补体C5阻断补体级联反应,逃避宿主免疫应答以达到致病的目的,为进一步探究SSL7的感染机制、揭示SSLs蛋白功能奠定基础。

【目的】了解上海和贵州地区引起奶牛乳房炎的金黄色葡萄球菌凝固酶基因型情况,为奶牛乳房炎的防治提供理论依据。【方法】利用16S rRNA保守序列设计引物,PCR扩增鉴定金黄色葡萄球菌,并利用凝固酶基因及其酶切产物多态性对分离鉴定出的金黄色葡萄球菌进行了凝固酶基因分型。【结果】共鉴定出78株金黄色葡萄球菌,有74株金黄色葡萄球菌扩增凝固酶基因片段,分为5个基因型和两个亚型。PCR 1型为贵州地区优势基因型,PCR 3型为上海地区优势基因型。【结论】两地区各基因型菌株分布比例有显著的地域性差异,这与两地区地理环境和养殖水平差异对病原流行传播的影响有关。

[目的]本文旨在研究一种新型的金黄色葡萄球菌选择性增菌培养基（SSA）。[方法]试验模拟即食果蔬加工环境的低热杀菌环境探索金黄色葡萄球菌亚致死情况，并以此为条件选出最优的基础培养基。挑选3种促进剂，6种抑制剂进行单因素筛选，从中选出四种因素进行响应面设计，得到最优配方组合。随后对优化得到的配方进行重复性、特异性、亚致死恢复验证实验与人工污染即食果蔬培养试验。[结果]优选出的最佳方案为以LB培养基为基础，向其中加入葡萄糖、丙酮酸钠、萘啶酮酸和苯乙醇至浓度1.73 g·L~(-1)、12.52 g·L~(-1)、3.82 mg·L~(-1)和1.60 mL·L~(-1)。热损伤金黄色葡萄球菌在SSA中培养120 min后的修复率达到100%，显著优于LB的89.2%与7.5%氯化钠肉汤的51.2%，金黄色葡萄球菌在SSA中培养的终浓度高于LB，生长速度大于7.5%氯化钠肉汤，而非金黄色葡萄球菌在SSA中的生长被抑制。[结论] SSA培养基能够有效抑制非目标菌的生长，同时促进金黄色葡萄球菌的生长，SSA培养基与分子检测法的结合可以提高检测准确性并在10小时内得到检测结果。

测定了41株金黄色葡萄球菌在无抗生素培养基和含4μg·mL~(-1)万古霉素培养基中的生长曲线,基于双变量全基因组关联分析(GWAS)筛选与表型可塑性显著相关的SNP位点.将14个时间点的显著位点按照-logP值由大到小排列,并筛选出现频率较高且-logP值较大的SNP位点.最终得到9个显著SNPs:位点738 836所在位置为非编码区;位点1 394 043和1 871 317所在基因编码假定蛋白;位点264 897所在基因与药物转运蛋白有关;位点382 501所在基因参与谷氨酸合成;位点2 535 773所在基因编码谷氨酸合酶亚基;位点615 798和1 842 166所在基因分别编码H~+反向转运蛋白亚基A和Ⅰ型限制修饰系统亚基;位点965 494所在基因编码双功能自溶素.双变量GWAS分析表明,表型可塑性与氨基酸合成、离子转运等基因的调控密切相关,但与最低抑菌浓度没有直接关联.

金黄色葡萄球菌是引起奶牛乳腺炎的主要病原体,因其具有细胞内定殖和对抗生素极易产生耐药性的特点,使得用抗生素治疗的效果越来越差,为此疫苗防治成为首选。黏附素在金黄色葡萄球菌致病过程中起着至关重要的作用,在金黄色葡萄球菌感染的早期,黏附素是最重要的致病因子,只有当金黄色葡萄球菌黏附到宿主细胞上,毒素和荚膜才能开始表达。因此阻断金黄色葡萄球菌感染的初始阶段,特别是阻止细菌黏附到细胞和定殖在黏膜表面,将是预防和治疗奶牛乳腺炎的最有效途径。因此近些年研究者致力于黏附素的结构及功能的研究,试图以黏附素为靶点设计金黄色葡萄球菌疫苗。本研究对近几年黏附素的种类和作用,以及其相关疫苗的研究进行了综述。