【背景】脂肪组织分为皮肤下的皮下脂肪组织(subcutaneous adipose tissue,SAT)和腹部内器官周围的内脏脂肪组织(visceral adipose tissue,VAT),皮下脂肪作为影响肉类美味与否的重要因素,探究皮下脂肪沉积分子调控机制对于育种改良和畜牧业的发展至关重要。Krüppel-like factors 12 (KLF12)是一个进化保守的转录因子,可以在多种细胞类型中表达并控制着广泛的细胞过程。【目的】研究获得山羊KLF12的分子特征并进行生物信息学分析,同时明确KLF12在山羊组织和细胞中的表达模式以及干扰KLF12对山羊皮下脂肪细胞分化的调控作用,为进一步研究KLF12在脂肪沉积过程中的潜在作用提供理论依据。【方法】利用逆转录PCR(reverse transcription PCR,RT-PCR)方法克隆山羊KLF12完整编码序列(coding sequence,CDS)区,使用在线生物信息学分析软件对山羊KLF12核苷酸序列和氨基酸序列进行分析。利用实时荧光定量PCR(Quantitative Real-time PCR,qRT-PCR)技术检测KLF12在山羊心脏、肝脏、腹部脂肪、皮下脂肪、臂三头肌、背最长肌等14个组织中的表达水平,以及诱导分化不同时间段KLF12在皮下前体脂肪细胞中的表达水平。随后,试验通过化学合成山羊KLF12小干扰RNA(si-KLF12),使用Lipofectamine RNAiMAX转染试剂将山羊si-KLF12序列转染到体外培养的山羊皮下前体脂肪细胞中。使用100μmol·L-1油酸导液诱导脂肪细胞分化。利用油红O以及Bodipy染色方法和qRT-PCR技术分别从形态学以及分子生物学的角度阐明干扰KLF12对皮下前体脂肪细胞脂滴积聚和脂肪分化标志基因mRNA表达水平的影响。【结果】试验成功获得包含开放阅读框(open reading frame,ORF)(1 209 bp)的山羊KLF12(1 315 bp,编码402个氨基酸)。亚细胞定位结果显示KLF12主要位于细胞核,此外,KLF12无跨膜结构域和信号肽,且在317—341、347—371及377—399氨基酸处存在3个典型的锌指结构域(ZnF_C2H2)。组织表达谱结果显示KLF12在山羊心脏和脾脏的表达水平极显著高于其他组织(P<0.01)。结合形态学观察结果以及脂肪分化标志基因表达水平变化情况,推测KLF12在皮下脂肪细胞分化过程中起到负调控作用。【结论】通过对山羊KLF12的分子生物学特征、组织细胞间的表达规律以及对山羊皮下脂肪细胞分化过程的潜在调控作用的研究表明,KLF12是山羊皮下脂肪细胞分化过程中的负调控因子,并且这种作用可能是通过调控LPL、PPARγ和Pref-1实现的,为进一步探究KLF12在调控脂肪细胞分化过程中的分子机制奠定了基础。

为分析山羊KLF16对肌内前体脂肪细胞分化的调控作用,利用RT-PCR克隆得到山羊KLF16基因序列,利用生物信息学分析山羊KLF16基因序列特征,通过过表达、油红O染色和qPCR等方法从形态学及分子水平分析过表达山羊KLF16后肌内脂肪细胞脂滴积聚及分化标志基因表达水平的变化。结果表明:1)克隆得到包含CDS区的山羊KLF16基因序列986bp,编码251个氨基酸,具有典型锌指结构;2)KLF16在山羊各组织广泛表达,其中腹部皮下脂肪组织表达量极显著高于其他组织(P<0.01);3)过表达山羊KLF16与对照组相比脂肪细胞脂滴积聚减少,分化标志基因PPARγ和PPARα极显著下调(P

【目的】探讨猪肌内脂肪细胞与皮下脂肪细胞的基因表达差异。【方法】通过改进的胶原酶消化法,分别从猪(大×长二元杂)皮下脂肪组织和背最长肌肌肉组织中分离脂肪前体细胞,用850nmol·L-1胰岛素和50nmol·L-1地塞米松诱导细胞分化,采用油红O提取法测定细胞分化过程中的聚酯水平。同时采用实时荧光定量PCR方法检测细胞分化过程中的转录调控因子基因(PPARγ、C/EBPβ与SREBP-1)、脂肪合成酶相关基因(GPDH、ACC和SCD-1)、脂肪酸转运相关基因(LPL、FAT与AP2)以及肌肉旁分泌因子受体基因(ACVR2B、IL-6R和IGF-1R)的表达模式。【结果】猪肌内脂肪前体细胞诱导...

【背景】脂肪酸转运蛋白1(FATP1)能够促进哺乳动物脂肪酸摄取，该过程对维持机体脂代谢平衡十分重要，也对家畜的肉质好坏有着重要影响。【目的】通过获得山羊FATP1的CDS区序列，检测该基因在山羊不同组织中的表达量，探究其对山羊肌内脂肪细胞脂质代谢的影响，为进一步揭示FATP1在山羊脂代谢中的作用机制提供参考，为山羊的遗传育种改良提供理论依据。【方法】利用RT-PCR方法克隆获得山羊FATP1的CDS区序列，利用在线工具分析其亲疏水性、跨膜区域、信号肽等生物学特性，并构建其氨基酸序列系统进化树。利用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)技术检测FATP1在山羊不同组织中的表达水平，构建其组织表达谱。利用构建的真核表达载体和筛选出的siRNA对山羊肌内脂肪细胞进行FATP1过表达和干扰处理，通过油红O染色和甘油三酯测定检测FATP1过表达和干扰后对山羊肌内脂肪细胞脂质沉积的影响，并通过RT-qPCR技术进一步探究该基因过表达和干扰后对脂质代谢相关基因表达的影响。【结果】克隆获得了FATP1CDS区1 941bp，共编码646个氨基酸残基，预测其分子式为C_(3196)H_(5026)N_(884)O_(898)S_(25)，推测该蛋白为碱性疏水稳定蛋白。三级结构预测显示，山羊与绵羊的FATP1蛋白质三级结构相似，而与牛的FATP1蛋白质三级结构略有不同。氨基酸序列系统进化树分析显示，山羊FATP1与绵羊亲缘关系最近。RT-qPCR检测发现FATP1在山羊小肠中表达量最高。油红O染色及甘油三酯测定表明过表达FATP1后山羊肌内脂肪细胞内脂滴数量增多，脂质含量增加，而干扰FATP1后则得到了相反的结果。进一步检测脂质代谢相关基因的表达变化，发现在山羊脂肪细胞中过表达FATP1后，脂肪酸合成、转运等相关基因AGPAT6(P<0.01)、PLIN1(P<0.01)、DGAT2(P<0.01)、FADS2(P<0.01)、FADS1(P<0.01)、ACSL1(P<0.01)及ELOVL3(P<0.05)的表达水平显著升高，而脂解相关基因ACOX1(P<0.01)的表达水平则显著降低；干扰FATP1后，脂肪酸转运、延长等相关基因SCD5(P<0.01)、FABP3(P<0.05)的表达量显著下降，脂解相关基因ACOX1(P<0.01)和CPT1B(P<0.05)的表达量显著上升。【结论】FATP1可能通过促进细胞脂质生成相关基因的表达，降低脂质降解相关基因的表达，从而显著促进山羊肌内脂肪细胞脂质的沉积，这些结果为进一步揭示FATP1在调控脂质代谢中的作用及分子机制提供了试验参考。

［目的］探讨过氧化物酶体增殖物激活受体γ（ｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｏｒ ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒγ，ｐｐａｒγ）在肌内和皮下脂肪细胞中的差异表达及其与脂质差异沉积的关系，并从ｍｉｒＮａｓ角度阐述ｐｐａｒγ基因差异表达的机制。［方法］用油红ｏ染色法检测肌内前体脂肪细胞与皮下前体脂肪细胞的分化聚脂能力；采用ｑｒｔ－ｐｃｒ与ＷｅｓｔｅｒＮ ｂｌｏｔ检测ｐｐａｒγ在肌内脂肪细胞和皮下脂肪细胞中的表达水平；通过生物信息学预测靶向ｐｐａｒγ的ｍｉｒＮａｓ，利用ｑｒｔ－ｐｃｒ检测候选ｍｉｒＮａｓ在肌内脂肪细胞和皮下脂肪细胞中的表达水平；用双荧光素酶报告系统鉴定候选ｍｉｒＮａｓ与．．．

【目的】探讨皮下脂肪和肌内脂肪对猪肉风味的贡献,为改善猪肉产品风味提供理论依据。【方法】在猪瘦肉中添加不同比例或种类的皮下脂肪,或在去脂猪肉中添加肌内或皮下脂肪,热处理后,用GC-MS和电子鼻对各样品的风味进行测定。【结果】在猪肉中添加不同比例或种类的皮下脂肪不会使挥发性风味物质在种类上发生显著变化,只是在部分物质的峰面积上有不同程度改变;偏最小二乘回归(PLSR)和电子鼻分析表明,添加不同种类或比例的皮下脂肪不会引起猪肉整体风味太大的改变。在去脂肉中添加5%的皮下脂肪后,挥发性物质中醛和酮的种类显著增加,总的峰面积增加了50%左右;添加5%的肌内脂肪后,酮和醛的种类也会显著增加,总的峰面积增...

为分析两种脂肪供能条件下3种不同油脂饮食对小鼠腹股沟皮下脂肪沉积及其巨噬细胞分型的影响，90只C57BL/6J小鼠被随机分为6组，分别饲喂低脂猪油（Lar-10%）、低脂菜籽油（Rap-10%）、低脂橄榄油（Oli-10%）、高脂猪油（Lar-30%）、高脂菜籽油（Rap-30%）和高脂橄榄油（Oli-30%）,16周后解剖取腹股沟皮下脂肪组织，并对其进行苏木精-伊红染色，活性氧（Reactive oxygen species,ROS）含量检测，M1、M2型巨噬细胞标记物（CD11c和CD206）荧光双染，并通过ELISA检测其含量。结果表明：1）在低脂饮食条件下，三种油脂对小鼠腹股沟皮下脂肪组织重量、脂肪细胞横截面积、腹股沟皮下脂肪ROS含量均无显著影响（P>0.05）;2）随着脂肪供能水平的提高，小鼠腹股沟皮下脂肪沉积显著增加（P<0.05），在高脂饮食条件下，Lar-30%组的小鼠腹股沟皮下脂肪组织重量显著高于Rap-30%和Oli-30%组（P<0.05），并且相对于其他两组，Oli-30%组小鼠腹股沟皮下脂肪组织中ROS含量极显著降低（P

【目的】通过分析西门塔尔牛肌内脂肪和皮下脂肪差异表达miRNA,及对重要的候选miRNA-27b进行靶基因预测及相关生物信息学分析,探索miRNA在动物肌内脂肪生长、发育过程中的作用及其调控机制。【方法】利用miRNA微阵列芯片技术对肌内脂肪和皮下脂肪miRNA表达谱进行检测和分析以筛选差异表达miRNA;qRT-PCR方法验证4个在肌内脂肪显著高表达的候选miRNAs;采用Targetscan生物信息学计算方法预测目标miR-27b(对肌内脂肪沉积可能起重要调节作用)的靶基因,并对靶基因进行GO注释描述、富集分析及KEGG富集。【结果】miRNA芯片分析发现肌内脂肪和皮下脂肪共有88个差异表...

为了研究ＰＰＡＲ信号通路在猪去势诱导的脂肪沉积中的作用，采集去势和非去势淮南猪（共６头，每组各３头）的皮下脂肪组织，提取总ＲＮＡ后构建文库，利用高通量测序技术检测ＰＰＡＲ通路相关基因表达量，表达差异基因的筛选阈值为Ｐ１。基于ｍＲＮＡ的差异分析以及ＫＥＧＧ富集分析发现，ＰＰＡＲ信号通路中１７个基因表达差异达到显著水平，其中１４个基因表达量上调、３个基因表达量下调。脑型脂肪酸结合蛋白基因（ＦＡＢＰ７）、甘油水孔蛋白基因（ＡＱＰ７）、视黄素Ｘ受体γ基因（ＲＸＲγ）等基因上调，而磷酸烯醇丙酮酸羧激酶１基因（ＰＣＫ１）、过氧化物酶体增殖物激活受体γ辅激活因子１α基因（Ｐ．．．

[目的]本文旨在探究脂联素受体2(AdipoR2)在C2C12肌管细胞与3T3-L1前体脂肪细胞共培养体系中对3T3-L1前体脂肪细胞葡萄糖吸收与消耗能力的影响。[方法]利用siRNA干扰AdipoR2基因表达,同时利用Transwell细胞培养小室对这2种细胞进行了共培养并检验相关基因的表达水平和细胞葡萄糖消耗能力的变化。[结果]使用siRNA干扰AdipoR2基因的表达后,3T3-L1前体脂肪细胞的AdipoR2基因和葡萄糖转运蛋白基因Slc2a1和Slc2a4表达水平显著下降,3T3-L1前体细胞每单位所消耗的葡萄糖量也显著下降。而在与C2C12细胞共培环境下,3T3-L1前体细胞中AdipoR2基因和葡萄糖转运蛋白Slc2a1、Slc2a4基因表达水平显著上调。同时,3T3-L1前体细胞单位消耗的葡萄糖量显著上升。进一步研究发现,AdipoR2能够有效调节3T3-L1前体脂肪细胞内葡萄糖转运蛋白基因的表达水平与葡萄糖的消耗能力。[结论]在C2C12肌管细胞共培体系中,AdipoR2能够加速3T3-L1前体脂肪细胞对葡萄糖的吸收。

为探讨核受体辅激活蛋白2(NCOA2)基因启动子区甲基化水平与其在肾周脂肪组织及皮下脂肪组织中差异表达的相关性,采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)方法检测NCOA2基因在肾周脂肪组织和皮下脂肪组织中的表达水平;通过构建系列NCOA2基因5'侧翼区缺失表达载体,并采用双荧光素酶报告系统鉴定NCOA2基因核心启动子区;在分析核心启动子区CpG岛的基础上,采用亚硫酸氢盐测序(BSP)法测定NCOA2基因核心启动子区CpG岛甲基化水平。结果表明:肾周脂肪组织中NCOA2基因的mRNA表达水平显著低于皮下脂肪组织;NCOA2基因核心启动子区位于-483~-179 bp;预测发现该区域存在1个CpG...

［目的］以新淮猪肌内脂肪和皮下脂肪为试验材料，探讨核受体辅激活蛋白３（ＮＣＯＡ３）启动子甲基化对其在肌内与皮下脂肪组织中差异表达的影响。［方法］采用ＲＴ－ＰＣＲ的方法检测ＮＣＯＡ３在肌内脂肪与皮下脂肪组织的表达水平。构建ＮＣＯＡ３启动子缺失报告载体，并采用双荧光报告基因系统分析启动子区域活性。预测ＮＣＯＡ３启动子区ＣＰ Ｇ岛，利用亚硫酸氢盐法（ＢＳＰ）检测２种脂肪组织ＮＣＯＡ３启动子区ＣＰ Ｇ岛甲基化水平，并通过甲基转移酶处理，以检测甲基化对ＮＣＯＡ３基因启动子活性的影响。［结果］ＮＣＯＡ３ ｍＲＮＡ在肌内脂肪组织中表达水平极显著低于皮下脂肪组织（Ｐ

【目的】优化山羊前体脂肪细胞体外培养体系,揭示Kruppel样转录因子家族(KLFs)成员在前体脂肪细胞分化过程中的表达模式。【方法】于四川省简阳大哥大牧业有限公司随机选取3只7日龄简州大耳羊为研究对象。放血致死并清洗后,在无菌环境中取其皮下脂肪组织。利用Ⅰ型胶原酶消化法获得其皮下前体脂肪细胞,待细胞长至细胞密度为80%时传代至6孔培养板中(F3代),以"150μmol·L~(-1)油酸+10 mg·L~(-1)胰岛素"前体脂肪细胞进行成脂诱导,并在诱导分化后0 d、3 d、5 d、7 d收集细胞,Trizol法提取细胞总RNA,利用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测KLF2~(-1)0, KLF 12和KLF15共11个KLF转录因子家族成员在不同分化阶段细胞中的表达水平,并利用皮尔逊系数分析各个成员mRNA总体表达水平之间的相关性。【结果】150μmol·L~(-1)油酸+10 mg·L~(-1)胰岛素处理前体脂肪细胞24 h后细胞中开始出现小脂滴,48 h后脂滴数量增多、体积增大,诱导120 h后脂肪细胞分化程度显著增加。RT-qPCR结果显示,脂肪分化标志基因过氧化物酶体增殖物活化受体γ(PPARγ)基因随着诱导分化的进行其表达水平持续上升,其中在第7天时其表达水平极显著高于其他各组(P<0.01)。KLF2、KLF3、KLF4、KLF6、KLF7和KLF15在脂肪细胞中表达水平显著(P<0.05)或极显著(P

【目的】腺苷甲硫氨酸转移酶(MAT)在ATP的作用下,催化生成体内重要的甲基供体S-腺苷甲硫氨酸(SAMe)。通过构建慢病毒介导的pLenti-H1干扰载体,探究腺苷甲硫氨酸转移酶MAT2A和MAT2B对猪肌内脂肪细胞分化的影响。【方法】无菌条件下采集3—7日龄小猪背最长肌,采用差速贴壁法分离猪肌内脂肪细胞。根据GenBank中猪MAT2A基因序列(AccessionNo.NM_001167650.1)和MAT2B基因序列(AccessionNo.NM_001142832.1),获得其CDS序列。利用Invitrogen公司在线软件BLOCK-iTTM RNAi Designer分别设计shRNA靶序列,将合成的单链寡核苷酸退火形成双链,与经过Bam H I和Xho I (TaKaRa)双酶切后的pLenti-Hl载体连接,转化,并提取质粒进行酶切和测序鉴定。采用X-tremeGENE-HP DNA转染试剂与测序成功的重组质粒以及包装质粒(CMV-Δ8.9和CMV-VSVG)共转染293T细胞,48 h后观察绿色荧光蛋白(GFP)的表达,并进行滴度测定。在猪原代脂肪细胞密度达到70%—80%时,侵染病毒;细胞密度融合时诱导分化。提取分化第8天的猪肌内脂肪细胞的RNA,按照反转录试剂盒操作说明进行反转录,合成cDNA第一链。采用primer primer 5软件设计MAT2A、MAT2B、PPARγ、aP2、CEBP/α、β-actin基因的定量引物,实时定量和Western blot试验检测MAT2A和MAT2B基因的干扰效率。油红O染色和实时定量鉴定MAT2A和MAT2B基因对猪肌内脂肪脂质积累的影响。【结果】酶切及测序证明重组慢病毒载体pLenti-Hl-MAT2A/MAT2B构建成功;包装的慢病毒sh-MAT2A和sh-MAT2B病毒滴度分别为6.7×107和7×107 pfu/mL,侵染肌内脂肪细胞72 h后,可出现90%的绿色荧光蛋白(GFP),表明所包装的病毒可满足侵染猪前体肌内脂肪细胞需要。实时定量结果显示其显著抑制了MAT2A和MAT2B的m RNA水平表达,其干扰效率分别在70%和60%以上;进一步采用Western blot试验及蛋白分析表明,干扰MAT2A基因后,MAT2A蛋白表达水平降低40%左右,差异达到极显著水平(P<0.01);干扰MAT2B基因后,MAT2B蛋白表达水平降低25%左右,差异达到显著水平(P

【目的】探讨体外培养条件下,LiCl诱导大鼠脂肪基质细胞向成骨细胞分化的潜能。【方法】采用Ⅰ型胶原酶消化组织块法分离获得大鼠脂肪基质细胞,将其分为处理组和对照组,分别用25 mmol/L LiCl和25mmol/L NaCl处理3周,采用形态学、SQ RT-PCR、免疫荧光染色、碱性磷酸酶染色及茜素红染色等方法,检测大鼠脂肪基质细胞向成骨细胞分化的能力。【结果】大鼠脂肪基质细胞在LiCl诱导24 h后,细胞形态由成纤维样变成方块状;诱导3周后,SQ RT-PCR检测发现,细胞表达碱性磷酸酶(AP)、Ⅰ型胶原(ColⅠ)和骨γ羧基谷氨酸(Bglap)等成骨细胞特异性基因,与处理0 d相比,差异达...