为建立油茶Camellia oleifera根腐病菌层生镰刀菌Fusarium proliferatum的巢式聚合酶链式反应(PCR)快速检测体系,扩增层生镰刀菌核糖体DNA基因间隔序列(ITS)区并测定其序列,比较该序列与GenBank中近似种的ITS序列差异,设计了特异性引物GF1和GR2,利用该对引物与ITS1和ITS4进行巢式PCR扩增检测层生镰刀菌。结果显示,巢式PCR对层生镰刀菌的检测灵敏度可达100ag基因组DNA,比常规扩增方法提高了1万倍。利用设计的GF1/GR2特异性引物与ITS区通用引物进行巢式PCR扩增,可灵敏地扩增出油茶根腐病菌层生镰刀菌DNA。

通过筛选特异性引物,优化多重PCR体系中的Mg2+、d NTP Mixture、Taq DNA聚合酶浓度,退火温度等反应条件,建立了多重PCR同时检测4种病菌(烟草黑胫病菌、根黑腐病菌、猝倒病菌和立枯病菌)的技术体系,得到265、364、400和541 bp共4条特异性条带,对应的病菌分别为猝倒病菌、黑胫病菌、根黑腐病菌、立枯病菌.该检测体系的灵敏度可达10-2ng·μL-1基因组DNA.

为了建立一种准确、快速检测三七根腐病病原真菌尖孢镰刀菌的实时荧光定量PCR方法,基于尖孢镰刀菌脂肪酸ω-羟化酶基因设计了实时荧光定量PCR的特异性引物对Fo-QF和Fo-QR,制备了该基因的重组质粒标准品,建立了尖孢镰刀菌的SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测方法。从三七种植区采集到14个具有根腐病、黑斑病典型症状的三七病株及三七种植土壤样品,并提取了这些样品的总DNA,运用本研究建立的荧光定量PCR方法进行了检测。结果显示,本研究建立的实时荧光定量PCR检测方法特异性强,脂肪酸ω-羟化酶基因只以尖孢镰刀菌DNA为模板扩增出特异的PCR产物。此外,该方法灵敏度高,检测模板浓度可低至0. 35 pg/μL。构建的荧光定量PCR标准曲线Ct值与模板浓度呈良好的线性关系,熔解曲线的吸收峰单一,扩增效率好。利用该定量检测体系,能从几种不同的三七病株中快速检测出携带尖孢镰刀菌的根腐病病株,从而达到准确诊断的目的。本方法不仅能明确三七种植土壤以及三七病株中尖孢镰刀菌数量的动态变化,并且可以为三七土壤处理、根腐病的早期诊断和动态监测以及带病三七种子、种苗的快速分子检测提供技术支持。

【目的】建立nested-PCR方法,快速检测西瓜种子中的燕麦嗜酸菌西瓜亚种(Acidovorax avenae subsp.citrulli,Aac),为西瓜细菌性果斑病(bacterial fruit blotch of watermelon,WFB)的防控提供技术支持。【方法】根据Aac BOX短重复序列的PCR产物设计两对引物BX-L1/BX-R5和BX-L1/BX-S-R2,建立以BX-L1/BX-R5为外侧引物,BX-L1/BX-S-R2为内侧引物的nested-PCR,以5μL样品处理液于99℃高温裂解10 min,再放置冰上冷却5 min,以所释放病原DNA为模板进行PCR扩增...

利用通用引物扩增了玉米细菌性枯萎病菌及其近似种的转录间隔区并进行了序列测定。通过序列比较,设计了一对玉米细菌性枯萎病菌的专化性引物,并对所有参试菌株进行扩增。结果显示:该对引物能从参试的玉米细菌性枯萎病菌中特异性地扩增出1条299bp的条带,而其他参试菌株没有扩增信号。与扩增细菌ITS区域的通用引物结合使用,建立了检测和鉴定玉米细菌性枯萎病菌的巢式PCR技术,其检测灵敏度可达到4个细菌细胞,可以准确、灵敏地检测和鉴定玉米细菌性枯萎病菌。

【目的】利用双重PCR技术快速检测马铃薯环腐病菌(Clavibacter michiganensis subsp.sepedonicus)和黑胫病菌(Pectobacterium atroseptica)。【方法】根据GenBank上发表的马铃薯环腐病菌pCS1质粒上纤维素酶A基因序列,对比近缘种及马铃薯上几种重要病原菌的核苷酸序列,设计并合成了1对特异性引物CMS1/CMS2,将设计的引物与已发表的PCR检测马铃薯黑胫病菌特异性引物ECA1f/ECA2r结合,经过条件优化后,建立了双重PCR体系。【结果】利用引物CMS1/CMS2扩增出了1条913 bp的马铃薯环腐病菌特异性条带。检测灵敏度...

麦根腐平脐蠕孢是玉米根腐病的重要病原菌之一，旨为建立一种基于环介导等温扩增技术(LAMP)的麦根腐平脐蠕孢快速检测方法。首先，根据麦根腐平脐蠕孢参与黑色素生物合成途径的Brn1基因部分序列设计了一套LAMP检测引物；然后，针对该引物组筛选了其最佳反应温度，检测了LAMP反应的特异性和灵敏度，并以人工接种麦根腐平脐蠕孢的玉米根腐病病株为样本评价了LAMP检测方法的效果。结果表明，本研究设计的引物组在61～68℃条件下均能实现对靶标基因的扩增，其中以66℃为最佳反应温度；在特异性检测中，引物组能从10种分离自玉米根腐病样本的主要病原真菌DNA中特异性地检测出麦根腐平脐蠕孢；在灵敏度检测中，对携带靶基因Brn1的质粒DNA最低检测限是10 copies/μL,在此检测限浓度下，25 min左右即可实现扩增；在对玉米根腐病样本检测中，在1 pg/μL的玉米根组织DNA中即可检测出麦根腐平脐蠕孢。建立的麦根腐平脐蠕孢LAMP检测方法具有较强的特异性和较高的灵敏度。

根据无乳链球菌（ＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕＳ ａｇａｌａｃｔｉａｅ）ｃｆｂ基因序列，设计、合成２对引物，优化扩增条件，建立了快速高灵敏度鉴别无乳链球菌的巢式ｐｃｒ方法。结果显示：使用该方法对罗非鱼（ｏｒｅｏｃｈｒｏｍｉＳ ｍｏＳＳａｍｂｉｃｕＳ）血液样品进行检测，可检测到活菌浓度为８．７×１０４ｃｆｕ／ｍ ｌ的无乳链球菌。对采自广西地区受无乳链球菌感染的１９份罗非鱼样品进行检测，１８份可获得目的片段，扩增到的序列均为无乳链球菌ｃｆｂ基因序列，检测准确度达到９４．７％。

【目的】建立快速、准确的大豆疫霉菌检测和病害早期诊断分子技术。【方法】基于大豆疫霉菌SSR标记Psc239设计两对引物Psc239EF/Psc239ER和Psc239F/Psc239R,建立特异性检测大豆疫霉菌的巢式PCR方法。【结果】用36个大豆疫霉菌分离物和25个其他卵菌和真菌分离物基因组DNA评价引物及巢式PCR的专化性,引物对Psc239EF/Psc239ER、Psc239F/Psc239R和巢式PCR反应只在大豆疫霉菌中分别扩增出519、242和242bp的特异片段,在其它卵菌和病原真菌中不扩增片段;用两对引物进行常规PCR扩增,检测大豆疫霉菌DNA的灵敏度均为50pg·μl-1,而...

【目的】建立巢式PCR方法，快速检测处于病害潜育期的玉米叶片内的多堆柄锈菌（Puccinia polysora），为玉米南方锈病（southern corn rust）的预测和防治提供技术支持。【方法】根据多堆柄锈菌ITS区序列，在其变异区设计3条多堆柄锈菌特异性检测引物NX471-F、NX255-F和NX255-R，建立以NX471-F与真菌ITS区通用引物ITS4为外侧引物，NX255-F/NX255-R为内侧引物的巢式PCR。采用20μL扩增体系：Ex Taq DNA聚合酶（5 U·μL~(-1))0.15μL、10×Ex Taq Buffer(Mg~(2+)plus)2μL,d NTP Mixture（各2.5 mmol·L~(-1))1.6μL，上下游引物（10μmol·L~(-1)）各0.3μL,DNA 1μL,14.65μL ddH_2O。扩增程序：利用外侧引物NX471-F/ITS4进行第一步PCR扩增，95℃预变性7 min;95℃变性30 s,55℃退火30 s,72℃延伸45 s,30个循环；72℃再延伸7 min。将扩增后的产物稀释20倍，取1μL用作第二步PCR的扩增模板，然后以内侧引物NX255-F/NX255-R进行第二步PCR扩增，95℃预变性7 min;95℃变性30 s,66℃退火30 s,72℃延伸26 s,30个循环；72℃再延伸7 min。同时选用内侧引物进行常规PCR扩增，扩增体系同巢式PCR，扩增程序除循环数为38，其余程序同巢式PCR的第二步PCR检测。在此条件下对多堆柄锈菌、高粱柄锈菌（Puccinia sorghi）、青杨叶锈病菌（Melampsora laricipopulina）和7种玉米常见病原菌进行特异性检测，对不同梯度多堆柄锈菌基因组DNA和3种人工接种病叶进行灵敏度检测。【结果】巢式PCR检测体系仅在检测多堆柄锈菌时，产生了255 bp的目的条带，其他菌株均未扩增出目的条带。巢式PCR检测体系对多堆柄锈基因组DNA的最低检测限为10 fg·μL~(-1)，是常规PCR检测体系灵敏度的500倍。当1 g人工接种病叶含500—2.5×10~4个多堆柄锈菌夏孢子时，常规PCR和巢式PCR检出阳性率分别0和85.71%，巢式PCR可检测出的夏孢子个数最少为1 000个；当1 g人工接种病叶中含1—7个夏孢子堆时，常规PCR和巢式PCR检出阳性率分别76.19%和100%，常规PCR可检测出的夏孢子堆个数最少为2个，巢式PCR可检测出1个及以上夏孢子堆；当1 g人工接种病叶中含1—7个侵染点时，常规PCR和巢式PCR检出阳性率分别14.29%和66.67%，检测出的侵染点个数最少分别为6个和3个。【结论】成功建立了一种以NX471-F/ITS4为外侧引物，NX255-F/NX255-R为内侧引物的巢式PCR检测方法，可快速、高效、准确检测玉米叶片中潜伏期的多堆柄锈菌。

根据风信子黄腐病菌(Xanthom onas hyacinthi,XHA)的fimA基因,合成了1对特异性引物JAAN/JARA,目的片段为226 bp,用来检测样本中有无目标细菌。用XHA全菌体免疫家兔,获得抗血清,建立了检测风信子黄腐病菌的间接免疫荧光染色检测技术。用上述两种方法对风信子黄腐病菌和人工接种发病样品进行检测。结果表明,这两种方法可以准确、灵敏地检测风信子黄腐病菌及带菌样品,方法简单、快速、实用,可以在口岸检疫中推广使用,以减少风信子黄腐病菌进入中国的风险。

由茶麋子葡萄座腔菌Ｂｏｔｒｙｏｓｐｈａｅｒｉａ ｄｏｔｈｉｄｅａ引起的山核桃Ｃａｒｙａ Ｃａｔｈａｙｅｎｓｉｓ干腐病是山核桃栽培过程中的主要病害，该病菌表现明显的＂潜伏侵染＂特性。研究山核桃树体中干腐病菌的定量检测技术对山核桃干腐病的预测预报及科学防治具有重要的指导意义。根据茶麋子葡萄座腔菌的ｅＦ１α基因设计特异性引物，通过普通聚合酶链式反应（ｐＣｒ）和实时荧光定量ｐＣｒ（ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ｐＣｒ）扩增发现引物ｅＦｒｔ－Ｆ１／ｒ１对山核桃干腐病病菌的特异性及扩增效率较高，可稳定扩增出２３０ Ｂｐ的目标条带。应用此特异性引物建立的实时荧光定量ｐＣｒ干腐病病菌检测方法能够定量检测出山核桃植株样品．．．

【目的】马铃薯疮痂病菌具有明显的组成多样性,通过筛选不同疮痂病菌的通用探针引物,建立针对该类病原菌的定性检测方法。【方法】以目前中国存在的不同致病种的代表菌株CPS-1(Streptomyces scabies)、CPS-2(S.galilaeus)、CPS-3(S.acidiscabies)、CPS-4(S.turgidiscabies)为材料,根据NCBI GenBank中已登记的疮痂病菌特有毒素合成基因簇中的基因txtA、txtB、txtC(P450)、txtD(nos)等序列设计引物,对不同菌株的基因组扩增,选择特异性和稳定性较高的引物作为探针引物,经温度梯度筛选优化反应体系后建立成熟...

[目的]建立水稻叶鞘网斑病的快速PCR检测体系,为该病害的早期诊断提供技术支持。[方法]以水稻叶鞘网斑病病原菌帚梗柱孢霉(Cylindrocladium scoparium Morgan)DNA为模板,分别以factor 1-α(tef1)和β-tubulin gene两个保守性极强的特定区域序列作为检测靶标,针对C.scoparium设计了EF-S-4/EF-A-4和BT-S-9/BT-A-9两对特异性引物,建立了水稻叶鞘网斑病的双基因联合PCR检测技术。[结果]该体系的最佳退火温度为58℃,DNA灵敏度检测限达到550 fg·μL-1,病原菌可扩增出大小分别为272 bp和157 bp的2...