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[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
杨继建 葛秀国 窦忠英
选择受精后30～50d的关中奶山羊胎儿为材料,参照小鼠原始生殖细胞(PGCs)分离得到了山羊的PGCs,将其分别培养在STO饲养层上,或与同源山羊成纤维细胞(GEF)及山羊睾丸支持细胞(GSCs)共培养。结果表明,3种方法均能获得类EG细胞。分离得到的类EG细胞在STO饲养层上仅传4代;培养在GEF上的效果最差,传至第3代时丢失;而在GSCs上培养的效果最好,可传6代。
关键词：
山羊 原生殖细胞 胚胎干细胞
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
葛秀国 华进联 杨继建 徐小明 窦忠英
从46例山羊胎儿中分离培养原始生殖细胞,发现胎龄在25～38d的胎儿原代培养时都可获得大量的细胞集落,适合做胚胎生殖细胞的分离培养,最高传至6代。以小鼠胎儿成纤维细胞(MEF)、山羊胎儿成纤维细胞(GEF)、牛胎儿成纤维细胞(BEF)为饲养层,在不添加细胞因子情况下,都可以培养出原代山羊的胚胎生殖细胞。传代结果表明,MEF的培养效果较好,但与GEF组差异不显著(P>0.05),BEF组培养效果较差(P0.05);而在传代过程中,以含LIF10ng/mL组培养效果最好,但与含...
关键词：
山羊 原始生殖细胞 胚胎干细胞
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
徐小明 华进联 冯秀亮 窦忠英
从4～15周龄的牛胎儿生殖嵴中分离得到牛原始生殖细胞,以STO(一种建系的小鼠胎儿成纤维细胞)及MEF(小鼠胎儿成纤维细胞)为饲养层抑制分化培养,其中1个细胞系传至4代。研究发现,STO较MEF更有利于牛类EG细胞的分离与培养,体长小于5cm的胎儿适合牛EG细胞分离与克隆。同时观察到这些细胞在体外进行自发性分化,可形成上皮样细胞、神经样细胞和成纤维样细胞。
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
于海生 华进联 王洪锋 杨炜峰 刘胜 蒋会婷 窦忠英
为了探讨人原始生殖细胞(primordial germ cells,PGCs)的体外分离培养条件及相关影响因素,以小鼠胚胎成纤维细胞(mouse embryonic fibroblasts,MEF)作为饲养层,室温下用1．25 g／L胰蛋白酶+0．2 g／L EDTA消化人胚胎组织5～9 min,或用1 g／L胶原酶(IV型)消化20～40 min,分离得到PGCs,然后用不同培养液培养,从培养液角度较为系统的研究原代培养人原始生殖细胞的条件。结果表明,在KSR培养液(体积分数15％ Knockout serum replacement+高糖DMEM+10 ng／mL人重组白血病抑制因子(LI...
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
刘胜 华进联 于海生 窦忠英
使用人类胚胎皮肤成纤维细胞(hESF)作饲养层,以血清替代物及一些细胞因子作无血清培养基,培养人类胚胎生殖(hEG)细胞。结果显示,在该培养体系下,人类胚胎生殖细胞能够存活、增殖,并表现出干细胞特有的形态学特征,具有很高的碱性磷酸酶(AP)活性,在体外能够保持未分化状态50 d左右。接种hEG细胞后,该体系能够比以前的人类胚胎生殖细胞培养体系形成更多的集落,并且这些集落AP活性维持更久。结果为人类胚胎生殖细胞的基础研究和临床应用提供了一种更为安全的培养方法。
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
肖小珺 蔡琳琳 秦洁 李碧春
利用Ficoll密度梯度离心,提取鸡胚第28期(孵化132h)性腺中的原始生殖细胞(PGCs),用不同的冷冻保护液,对PGCs采用分离后直接冷冻保存和体外培养24h后冷冻保存2种方法,以筛选合适的冷冻保护体系。结果发现,分离提纯后直接进行冷冻保存的PGCs,存活率最高为(87.07±1.29)%;体外培养24h后进行冷冻的PGCs,存活率最高为(44.08±1.19)%。对复苏后的PGCs进行体外培养结果发现,分离提纯后直接进行冷冻的PGCs,在体外培养过程中具有形成细胞克隆的能力,且可传代和进行体外分化;而体外培养24h后进行冷冻的PGCs,复苏后在体外培养过程中不能形成细胞克隆,且在体外...
关键词：
鸡 原始生殖细胞 冷冻保存 体外培养
[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
芮荣 邱妍 胡元亮 范必勤
以质粒DNA为增强型绿色荧光蛋白 (EGFP)的载体 ,对处于快速增殖期的 8株猪胚胎生殖 (EG)细胞 (4～ 9代 )进行转基因试验。用 1μgDNA和 2 μLLipofecTamine 2 0 0 0转染EG细胞后 ,共获得 4株转染EGFP基因的EG细胞系 (EG EGFP) ,可发出强绿色荧光 ;EG EGFP细胞连续培养 2周以上可分化为多种细胞类型。显微注射EG EGFP细胞至卵裂期胚胎、桑椹胚卵周隙内或囊胚腔中 ,共注射 135枚胚胎 ,其中 112枚存活并发育至囊胚 (83 0 % ) ;86枚嵌合体胚培养后含有荧光细胞 ,其中 5 7枚囊胚在内细胞团 (ICM)上发现有E...
[期刊] 华中农业大学学报
[作者]
王慧利 李静心 王婧 孟春花 朱前明 张俊 钱勇 曹少先
为进一步完善猪胚胎体外发育系统,以孤雌激活胚胎为研究对象,依次对胚胎培养液种类、培养期间血清添加方式、卵丘细胞共培养体系进行筛选优化。结果表明,与常规的PZM3培养液相比,CR1aa并不适合猪胚胎的体外发育;猪胚胎在PZM3中培养4d后添加10%胎牛血清培养至第6天,体外发育能力得到显著改善,卵裂率、囊胚率、囊胚孵化率、囊胚细胞数分别达到95.1%、56.5%、27.3%、79.3;在此基础上,利用山羊卵丘细胞与猪胚胎进行共培养,将囊胚孵化率进一步提高至36.6%,初步建立了一套高效稳定的猪胚胎体外发育系统。
关键词：
猪胚胎 体外发育 血清 共培养 凋亡
[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
张艳丽 许丹 庞训胜 万永杰 王子玉 孟立 宋辉 王锋
为获得转基因克隆羊的供体细胞,本试验采用组织块培养法结合胰蛋白酶消化法分离纯化得到奶山羊胎儿成纤维细胞(gFFs),绘制了生长曲线,鉴定了胎儿细胞性别及核型特征,并且研究了脂质体量、质粒量和转染时间对gFFs的绿色荧光蛋白(GFP)转染效率的影响。结果表明:该培养体系可以支持奶山羊胎儿成纤维细胞的体外生长,其细胞形态为梭形,高度汇合后呈火焰状,增殖特性以及核型特征均为正常,性别鉴定显示该奶山羊胎儿细胞为雌性,符合体细胞转基因克隆的基本要求。24孔板中采用脂质体转染试剂4.0μL、质粒DNA 1.2μg,转染6 h可以获得最佳的转染效果,转染效率达4.21%。
[期刊] 中国农业科学
[作者]
睢梦华 郑琪 吴昊 丁建平 刘勇 李文雍 储明星 张子军 凌英会
【目的】通过体外建立安淮山羊胎儿肌肉干细胞分离培养及成肌诱导分化的方法,为进一步研究调控山羊肌肉干细胞增殖与分化的分子机制提供实验材料。【方法】本试验选取山羊胎儿背最长肌肌肉组织,用眼科剪剪成肉糜后,用0.1%的Ⅰ型胶原酶消化40 min,然后利用0.25%的胰酶消化15 min。分离得到的细胞用生长培养基(20%FBS+80%DMEM/F12+青链霉素)培养于37℃、5%CO2培养箱内。培养2h后采用差速贴壁技术对细胞进行纯化,又2h后,重复纯化一次。待细胞生长至70%左右密度时可进行传代培养。每次传代培养均采用差速贴壁30min的方法进一步纯化肌肉干细胞,共纯化至第6代。利用免疫荧光技术检测第6代细胞中肌肉干细胞标记基因Pax7、Myo D1的蛋白表达情况,从而对分离得到的细胞进行鉴定。当肌肉干细胞生长至70%左右密度时,将生长培养基更换为分化培养基(2%FBS+98%DMEM/F12+青链霉素),诱导细胞向成肌方向分化并观察细胞的形态学变化。细胞诱导分化1d后,采用免疫荧光技术检测肌肉干细胞的分化标记基因Myog的蛋白表达情况。另外,分别提取诱导0、1、3、5、7d后的细胞的总RNA,通过反转录试剂盒反转成c DNA后,利用q PCR测定Myo D1和Myog的相对表达量。【结果】分离得到的细胞呈贴壁生长,其形态趋于稳定后主要呈长梭形或纺锤形。免疫荧光技术检测的第6代细胞中Pax7和Myo D1蛋白均为阳性表达。采用分化培养基诱导细胞分化后,在显微镜下可观察到随着诱导天数的增加,细胞开始分化、相互融合成肌管且具有一定的方向性。免疫荧光检测结果表明Myog蛋白呈明显的阳性表达。另外,q PCR结果显示,标志基因Myo D1和Myog均有表达,且Myo D1的相对表达量在分化的第1天相比于0天显著升高并维持到第3天,第5、7天开始显著下降但仍显著高于增殖期。Myog在分化不同天数的细胞中的相对表达量具有类似的趋向。【结论】分离得到了纯度较高的安淮山羊胎儿肌肉干细胞,且诱导后展现出较好的成肌潜力。研究结果可为进一步开展肌肉干细胞成肌分化的分子机制研究提供材料来源。
[期刊] 中国农业大学学报
[作者]
李小芬 詹康 张响英 陶勇 杨晓志 顾文婕
为研究山羊小肠上皮细胞营养吸收调控及其与肠道微生物之间的关系,提供原代细胞培养模型,采用组织块接种来获得山羊小肠上皮细胞,利用有限稀释法来克隆山羊小肠上皮细胞,并通过细胞形态学以及细胞角蛋白18、波形蛋白、肌间线蛋白和细胞生长曲线来鉴定山羊小肠上皮细胞。结果表明:1)采用组织块接种能够分离纯化得到山羊小肠上皮细胞并稳定传至大约10代;2)RT-PCR检测发现山羊小肠上皮细胞不能够表达波形蛋白和肌间线蛋白;3)在正置显微镜下观察到山羊小肠上皮细胞能够产生细胞角蛋白18绿色荧光。研究发现,培养至第8代的山羊小
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
吴庆侠 丰艳妮 楚元奎 吴瑞 崔贞亮 靳亚平
对山羊子宫内膜基质细胞进行分离与体外培养,研究其生长特性,并对其进行免疫细胞化学染色鉴定。结果表明,山羊子宫内膜在37℃条件下,以2 g／L的胶原酶Ⅰ型消化3～4 h效果最好;采用过滤—低速离心—沉降相结合的方法分离山羊子宫内膜基质细胞效果较好,所得细胞在培养后0．5 h开始贴壁,培养12 h后,可见梭形和多角形2种形态的细胞,3～4 d呈网状铺满皿底,有明显的重叠生长现象;免疫细胞化学染色显示这2种形态的细胞均表达波形蛋白,阳性率可达95％以上,不表达角蛋白。说明采用本文所述的消化和分离方法可获得高纯度的子宫内膜基质细胞。
关键词：
山羊 子宫内膜 基质细胞 免疫细胞化学
[期刊] 中国农业科学
[作者]
丛义梅 马婧 孙瑞珍 王健宇 薛冰华 胡魁 尹智 刘忠华
【目的】探讨猪类胚胎生殖细胞向神经细胞分化的潜能。【方法】采用性腺-中肾区基质细胞与猪原始生殖细胞共培养的方法得到猪类胚胎生殖细胞,通过直接分化的方法进行神经细胞定向诱导。【结果】(1)与小鼠成纤维细胞作为饲养层相比,性腺-中肾区基质细胞作为饲养层同样能够支持猪类胚胎生殖细胞生长,二者对猪类胚胎生殖细胞的增殖能力不存在显著影响;(2)猪类胚胎生殖细胞有较强的碱性磷酸酶活性,Q-PCR结果显示多能性基因Oct4、Sox2及Nanog表达,增殖能力呈现"S"型,即生长的潜伏期、对数期及平台期,猪类胚胎生殖细胞经体外悬浮培养能够形成拟胚体;(3)经过诱导猪类胚胎生殖细胞能够分化形成表达神经干细胞、神...
关键词：
类胚胎生殖细胞 体外诱导 神经细胞 猪
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
郭志林 王新庄 张涌 王木 王轶敏 胡文举
采用大鼠心肌细胞条件培养基对兔胚胎干细胞(Embryonic stem cells,ESC)进行分离、传代培养,研究大鼠心肌细胞条件培养基对兔ESC分离培养效果的影响。结果显示,用SD大鼠心肌细胞条件培养基培养的兔ESC集落呈岛屿状生长,碱性磷酸酶染色呈强阳性,体外分化可形成类胚体状结构,贴壁的类胚体周边会出现许多分化的上皮样细胞或单个散在的细胞;常规冻存后再传代的兔ESC集落具有较为一致的生长特征,并呈现胚胎干细胞集落所特有的岛屿状生长形态;传至第5代的兔ESC集落核型正常率>75％。表明SD大鼠心肌细胞条件培养基可用于兔胚胎干细胞分离培养。
[期刊] 中国农业大学学报
[作者]
王菊花 刘丹丹 刘琦 王佳明 董静 周杰 薛秀恒
为探究在体外培养过程中山羊睾丸支持细胞(GSCs)存在的氧化应激问题,采用2步酶消化法分离和纯化GSCs,通过形态学观察、MTT法、油红染色和流式细胞鉴定细胞活度和纯度,再用不同浓度的H2O2处理GSCs,研究GSCs的活性、丙二醛(MDA)含量和超氧化物歧化酶(SOD)活性及其DNA指数(DI)的变化。结果表明:GSCs形态为多角形状;在培养至第5天时GSCs活性最强;油红O染色鉴定多数细胞胞质含有红色的脂滴;GATA4阳性细胞率达到88.27±3.29%;添加50μmol/L H2O2组细胞存活率与对照组相比差异不显著(P>0.05),其它各组均显著低于对照组(P0.05),而其他各组均与对照组有显著差异(P
关键词：
山羊 支持细胞 分离和培养 氧化应激
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