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[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
杨继建 葛秀国 窦忠英
选择受精后30～50d的关中奶山羊胎儿为材料,参照小鼠原始生殖细胞(PGCs)分离得到了山羊的PGCs,将其分别培养在STO饲养层上,或与同源山羊成纤维细胞(GEF)及山羊睾丸支持细胞(GSCs)共培养。结果表明,3种方法均能获得类EG细胞。分离得到的类EG细胞在STO饲养层上仅传4代;培养在GEF上的效果最差,传至第3代时丢失;而在GSCs上培养的效果最好,可传6代。
关键词：
山羊 原生殖细胞 胚胎干细胞
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
葛秀国 华进联 杨继建 徐小明 窦忠英
从46例山羊胎儿中分离培养原始生殖细胞,发现胎龄在25～38d的胎儿原代培养时都可获得大量的细胞集落,适合做胚胎生殖细胞的分离培养,最高传至6代。以小鼠胎儿成纤维细胞(MEF)、山羊胎儿成纤维细胞(GEF)、牛胎儿成纤维细胞(BEF)为饲养层,在不添加细胞因子情况下,都可以培养出原代山羊的胚胎生殖细胞。传代结果表明,MEF的培养效果较好,但与GEF组差异不显著(P>0.05),BEF组培养效果较差(P0.05);而在传代过程中,以含LIF10ng/mL组培养效果最好,但与含...
关键词：
山羊 原始生殖细胞 胚胎干细胞
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
徐小明 华进联 冯秀亮 窦忠英
从4～15周龄的牛胎儿生殖嵴中分离得到牛原始生殖细胞,以STO(一种建系的小鼠胎儿成纤维细胞)及MEF(小鼠胎儿成纤维细胞)为饲养层抑制分化培养,其中1个细胞系传至4代。研究发现,STO较MEF更有利于牛类EG细胞的分离与培养,体长小于5cm的胎儿适合牛EG细胞分离与克隆。同时观察到这些细胞在体外进行自发性分化,可形成上皮样细胞、神经样细胞和成纤维样细胞。
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
于海生 华进联 王洪锋 杨炜峰 刘胜 蒋会婷 窦忠英
为了探讨人原始生殖细胞(primordial germ cells,PGCs)的体外分离培养条件及相关影响因素,以小鼠胚胎成纤维细胞(mouse embryonic fibroblasts,MEF)作为饲养层,室温下用1．25 g／L胰蛋白酶+0．2 g／L EDTA消化人胚胎组织5～9 min,或用1 g／L胶原酶(IV型)消化20～40 min,分离得到PGCs,然后用不同培养液培养,从培养液角度较为系统的研究原代培养人原始生殖细胞的条件。结果表明,在KSR培养液(体积分数15％ Knockout serum replacement+高糖DMEM+10 ng／mL人重组白血病抑制因子(LI...
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
肖小珺 蔡琳琳 秦洁 李碧春
利用Ficoll密度梯度离心,提取鸡胚第28期(孵化132h)性腺中的原始生殖细胞(PGCs),用不同的冷冻保护液,对PGCs采用分离后直接冷冻保存和体外培养24h后冷冻保存2种方法,以筛选合适的冷冻保护体系。结果发现,分离提纯后直接进行冷冻保存的PGCs,存活率最高为(87.07±1.29)%;体外培养24h后进行冷冻的PGCs,存活率最高为(44.08±1.19)%。对复苏后的PGCs进行体外培养结果发现,分离提纯后直接进行冷冻的PGCs,在体外培养过程中具有形成细胞克隆的能力,且可传代和进行体外分化;而体外培养24h后进行冷冻的PGCs,复苏后在体外培养过程中不能形成细胞克隆,且在体外...
关键词：
鸡 原始生殖细胞 冷冻保存 体外培养
[期刊] 中国农业大学学报
[作者]
李小芬 詹康 张响英 陶勇 杨晓志 顾文婕
为研究山羊小肠上皮细胞营养吸收调控及其与肠道微生物之间的关系,提供原代细胞培养模型,采用组织块接种来获得山羊小肠上皮细胞,利用有限稀释法来克隆山羊小肠上皮细胞,并通过细胞形态学以及细胞角蛋白18、波形蛋白、肌间线蛋白和细胞生长曲线来鉴定山羊小肠上皮细胞。结果表明:1)采用组织块接种能够分离纯化得到山羊小肠上皮细胞并稳定传至大约10代;2)RT-PCR检测发现山羊小肠上皮细胞不能够表达波形蛋白和肌间线蛋白;3)在正置显微镜下观察到山羊小肠上皮细胞能够产生细胞角蛋白18绿色荧光。研究发现,培养至第8代的山羊小
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
吴庆侠 丰艳妮 楚元奎 吴瑞 崔贞亮 靳亚平
对山羊子宫内膜基质细胞进行分离与体外培养,研究其生长特性,并对其进行免疫细胞化学染色鉴定。结果表明,山羊子宫内膜在37℃条件下,以2 g／L的胶原酶Ⅰ型消化3～4 h效果最好;采用过滤—低速离心—沉降相结合的方法分离山羊子宫内膜基质细胞效果较好,所得细胞在培养后0．5 h开始贴壁,培养12 h后,可见梭形和多角形2种形态的细胞,3～4 d呈网状铺满皿底,有明显的重叠生长现象;免疫细胞化学染色显示这2种形态的细胞均表达波形蛋白,阳性率可达95％以上,不表达角蛋白。说明采用本文所述的消化和分离方法可获得高纯度的子宫内膜基质细胞。
关键词：
山羊 子宫内膜 基质细胞 免疫细胞化学
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
刘胜 华进联 于海生 窦忠英
使用人类胚胎皮肤成纤维细胞(hESF)作饲养层,以血清替代物及一些细胞因子作无血清培养基,培养人类胚胎生殖(hEG)细胞。结果显示,在该培养体系下,人类胚胎生殖细胞能够存活、增殖,并表现出干细胞特有的形态学特征,具有很高的碱性磷酸酶(AP)活性,在体外能够保持未分化状态50 d左右。接种hEG细胞后,该体系能够比以前的人类胚胎生殖细胞培养体系形成更多的集落,并且这些集落AP活性维持更久。结果为人类胚胎生殖细胞的基础研究和临床应用提供了一种更为安全的培养方法。
[期刊] 中国农业大学学报
[作者]
王菊花 刘丹丹 刘琦 王佳明 董静 周杰 薛秀恒
为探究在体外培养过程中山羊睾丸支持细胞(GSCs)存在的氧化应激问题,采用2步酶消化法分离和纯化GSCs,通过形态学观察、MTT法、油红染色和流式细胞鉴定细胞活度和纯度,再用不同浓度的H2O2处理GSCs,研究GSCs的活性、丙二醛(MDA)含量和超氧化物歧化酶(SOD)活性及其DNA指数(DI)的变化。结果表明:GSCs形态为多角形状;在培养至第5天时GSCs活性最强;油红O染色鉴定多数细胞胞质含有红色的脂滴;GATA4阳性细胞率达到88.27±3.29%;添加50μmol/L H2O2组细胞存活率与对照组相比差异不显著(P>0.05),其它各组均显著低于对照组(P0.05),而其他各组均与对照组有显著差异(P
关键词：
山羊 支持细胞 分离和培养 氧化应激
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
刘大勇 杨学义 窦忠英
采用组织块法和酶消化法对山羊表皮干细胞进行分离,对分离的表皮干细胞进行了免疫组化染色鉴定,并对其进行了增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因转染研究。结果表明,2种方法均能得到山羊表皮干细胞,其中组织块培养法简单易行,组织块可重复利用,但原代细胞脱出时间较长,平均为8 d,且培养季节对细胞脱出时间、原代传代时间、传代数有显著影响;酶消化法周期短,8 d左右即可传代,不同培养季节对细胞克隆形成时间、细胞传代时间和传代数无显著影响,但处理过程繁琐。EGFP基因在转染表皮干细胞24 h后大量表达,转染率达20%~30%,72 h时转染强度最大,荧光可持续5周;转染使细胞增殖能力明显下降。
关键词：
绿色荧光蛋白 山羊 表皮干细胞 转染
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
潘少辉 胡玥 张姗姗 王静 李飞飞 高志敏 杨春荣 华进联
【目的】从成年昆明小鼠睾丸组织中分离具有多能性的雄性生殖干细胞(Male germline stem cells,mGSCs)。【方法】采用机械法和2步酶消化法分离出成年昆明小鼠的精原细胞,经差速贴壁后,培养在小鼠胎儿成纤维细胞(MEF)饲养层上,2周后得到类胚胎干细胞(ESCs)样mGSCs。对得到的mGSCs进行碱性磷酸酶(AP)染色、免疫荧光染色、RT-PCR、体内分化等检测。【结果】mGSCs具有类似ESCs的形态和多能性,AP染色呈阳性,免疫荧光Oct4、Vasa染色呈阳性,RT-PCR检测其表达Oct4、Nanog、Sox2等多能性基因和Vasa、C-kit等生殖细胞的标记基因,在...
[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
张艳丽 许丹 庞训胜 万永杰 王子玉 孟立 宋辉 王锋
为获得转基因克隆羊的供体细胞,本试验采用组织块培养法结合胰蛋白酶消化法分离纯化得到奶山羊胎儿成纤维细胞(gFFs),绘制了生长曲线,鉴定了胎儿细胞性别及核型特征,并且研究了脂质体量、质粒量和转染时间对gFFs的绿色荧光蛋白(GFP)转染效率的影响。结果表明:该培养体系可以支持奶山羊胎儿成纤维细胞的体外生长,其细胞形态为梭形,高度汇合后呈火焰状,增殖特性以及核型特征均为正常,性别鉴定显示该奶山羊胎儿细胞为雌性,符合体细胞转基因克隆的基本要求。24孔板中采用脂质体转染试剂4.0μL、质粒DNA 1.2μg,转染6 h可以获得最佳的转染效果,转染效率达4.21%。
[期刊] 中国农业科学
[作者]
睢梦华 郑琪 吴昊 丁建平 刘勇 李文雍 储明星 张子军 凌英会
【目的】通过体外建立安淮山羊胎儿肌肉干细胞分离培养及成肌诱导分化的方法,为进一步研究调控山羊肌肉干细胞增殖与分化的分子机制提供实验材料。【方法】本试验选取山羊胎儿背最长肌肌肉组织,用眼科剪剪成肉糜后,用0.1%的Ⅰ型胶原酶消化40 min,然后利用0.25%的胰酶消化15 min。分离得到的细胞用生长培养基(20%FBS+80%DMEM/F12+青链霉素)培养于37℃、5%CO2培养箱内。培养2h后采用差速贴壁技术对细胞进行纯化,又2h后,重复纯化一次。待细胞生长至70%左右密度时可进行传代培养。每次传代培养均采用差速贴壁30min的方法进一步纯化肌肉干细胞,共纯化至第6代。利用免疫荧光技术检测第6代细胞中肌肉干细胞标记基因Pax7、Myo D1的蛋白表达情况,从而对分离得到的细胞进行鉴定。当肌肉干细胞生长至70%左右密度时,将生长培养基更换为分化培养基(2%FBS+98%DMEM/F12+青链霉素),诱导细胞向成肌方向分化并观察细胞的形态学变化。细胞诱导分化1d后,采用免疫荧光技术检测肌肉干细胞的分化标记基因Myog的蛋白表达情况。另外,分别提取诱导0、1、3、5、7d后的细胞的总RNA,通过反转录试剂盒反转成c DNA后,利用q PCR测定Myo D1和Myog的相对表达量。【结果】分离得到的细胞呈贴壁生长,其形态趋于稳定后主要呈长梭形或纺锤形。免疫荧光技术检测的第6代细胞中Pax7和Myo D1蛋白均为阳性表达。采用分化培养基诱导细胞分化后,在显微镜下可观察到随着诱导天数的增加,细胞开始分化、相互融合成肌管且具有一定的方向性。免疫荧光检测结果表明Myog蛋白呈明显的阳性表达。另外,q PCR结果显示,标志基因Myo D1和Myog均有表达,且Myo D1的相对表达量在分化的第1天相比于0天显著升高并维持到第3天,第5、7天开始显著下降但仍显著高于增殖期。Myog在分化不同天数的细胞中的相对表达量具有类似的趋向。【结论】分离得到了纯度较高的安淮山羊胎儿肌肉干细胞,且诱导后展现出较好的成肌潜力。研究结果可为进一步开展肌肉干细胞成肌分化的分子机制研究提供材料来源。
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
杨炜峰 葛秀国 杨春荣 马晓玲 华进联 窦忠英
对32只关中奶山羊进行超排处理,获得胚胎263枚,其中囊胚122枚。采用机械法、酶消化法和免疫外科法分离囊胚83枚,得到内细胞团(ICM)65个。将ICM培养于小鼠胎儿成纤维细胞饲养层上,研究含血清和无血清条件下ICM的增殖规律,并比较添加不同生长因子对ICM增殖的影响。结果表明,无血清培养时,ICM细胞增殖相对较慢,分化减少;添加LIF、bFGF、两种同时添加或均不添加对原代ESC样集落形成率的影响不显著(P>0.05),但添加10 ng/mL bFGF稍微有助于ICM增殖。山羊ICM适宜于无血清培养。
[期刊] 水产学报
[作者]
陈仕海 蔡明夷 张子平 韩坤煌 姜永华 张伟军 王艺磊
在鱼类的早期胚胎发育中生殖细胞便与体细胞分离,形成所谓的原始生殖细胞(primordial germ cells,PGCs)。母源性基因Dead end(dnd)在胚胎发育中特异地表达于原始生殖细胞,编码一种进化上保守的RNA结合蛋白,对生殖细胞发育具有重要作用。本研究通过PCR获得大黄鱼dnd基因(Lcdnd)的部分c DNA序列,结合实时定量PCR、整胚原位杂交等技术,研究Lcdnd在各组织和胚胎发育中的表达。实时定量PCR结果显示:dnd在性腺中特异表达,且其在卵巢中的表达量高于精巢;检测的各期胚胎中都有dnd的表达,随着胚胎发育其表达量呈下降趋势。整胚原位杂交结果显示:Lcdnd在早期...
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