为研究乳腺上皮细胞增殖和分化特性及其基因表达的分子机制 ,建立了山羊乳腺上皮细胞培养体系。用无菌手术法从健康第二胎泌乳期山羊乳腺取得组织块 ,在体外条件下用组织块法进行原代培养。基础培养液用 RPMI1 6 4 0 ,含胎牛血清 1 5 0 m L/ L,添加 EGF(1 0 μg/ L)、胰岛素 (0 .1 m g/ L)、E2 (1 μg/ L)、氢化可的松 (0 .1mg/ L)、孕酮 (1 m g/ L)、青霉素 (0 .1 g/ L)及链霉素 (0 .0 5 g/ L) ,在铺有胶原的塑料培养板上培养。从细胞接种存活率、细胞群体倍增时间、细胞生长曲线和细胞分裂指数 4个方面考察了乳腺...

　通过有效的细胞培养方法获得山羊乳腺上皮细胞系,对这些细胞形态进行光镜观察,结果发现,细胞可形成闭合型和开放型细胞群,闭合型细胞群边界清晰,细胞之间结合紧密;开放型细胞群边界不清,细胞相互分散存在于一局限的范围内。乳腺上皮细胞与成纤维细胞混生时分区生长,界线明显;细胞之间形成许多腔状结构。纯化的乳腺上皮细胞通过单细胞悬浮后传代,部分细胞形成岛屿状聚集,部分细胞以贴壁的自由单个细胞散在形式存在。上皮细胞增殖可形成圆顶型结构,呈乳头状(称之为乳球体);乳腺上皮细胞可产生并分泌乳汁,分泌到细胞外的乳汁流动形成网状结构。山羊乳腺上皮细胞含不同的细胞类型,大多数上皮细胞呈短梭形或多角形,细胞之间紧密相靠...

【目的】建立奶山羊乳腺上皮细胞体外培养方法,并对原代和传代细胞进行形态观察。【方法】分别采用组织块法和胶原酶消化法培养奶山羊原代乳腺上皮细胞,然后通过胰酶消化法结合反复贴壁法纯化细胞,免疫组化法鉴定细胞,并利用倒置显微镜观察细胞形态。【结果】组织块法和胶原酶消化法均能培养奶山羊原代乳腺上皮细胞;纯化获得的细胞呈卵圆形或多角形,形成典型的鹅卵石或铺路石样,且细胞角蛋白检测呈阳性;多次传代后乳腺上皮细胞出现分化现象,形态多样,增殖仍然旺盛。【结论】成功建立了一种简单易行、经济而实用的奶山羊乳腺上皮细胞体外培养方法。

分别用5,10和15μg／mL二甲基苯蒽(DMBA)的完全培养液处理体外培养的山羊乳腺上皮细胞36, 24和12 h,再以25 ng／mL佛波酯(TPA)作用2周,研究DMBA和TPA对山羊乳腺上皮细胞的诱导转化作用,确定最佳诱导转化条件,探讨二甲基亚砜(DMSO)对细胞增殖的影响。结果表明,用含15μg／mL DMBA的完全培养液培养12 h,再用TPA连续作用4 d,几乎无山羊乳腺上皮细胞存活,10μg／mL DMBA培养24 h转化效果较差,5μg／mL DMBA培养36 h转化效果最佳;转化的山羊乳腺上皮细胞体积增大、核浓缩、生长排列紊乱、无规则并出现转化灶; DMSO对细胞生长有抑制...

为建立一种快速分离犬原代乳腺上皮细胞的培养方案，本研究旨在从健康泌乳金毛犬的乳汁中分离原代乳腺上皮细胞，接种于两种不同的培养基后传代培养，探讨不同培养基下细胞的生物学特征，提供犬乳腺上皮细胞简单便捷的分离措施及适宜的培养方法。选取泌乳一周的金毛犬在无菌条件下收集乳汁，离心处理后得到乳腺上皮细胞，分别用完全培养基和基础培养基接种培养，经形态学对比观察，间接免疫荧光检测角蛋白8(Cytokeratin 8)表达情况，绘制两种培养基培养下的第3代乳腺上皮细胞生长曲线；探讨完全培养基培养的第6代乳腺上皮细胞的冻存复苏活力。结果表明：1)乳汁分离可得到大量细胞团块，分别接种两种培养基后都会出现“煎蛋样”贴壁细胞，消化传代后两者均有Cytokeratin 8的高度表达；2)接种于基础培养基的细胞前期以聚集在一起的圆形单克隆细胞团块为主，传至第4代仅有少量细胞存活，细胞随着培养时间增加而状态变差，死亡细胞增多；接种于完全培养基的细胞整体呈“鹅卵石铺路样”成片生长，随着传代次数增加细胞状态稳定，细胞生长曲线呈现“S”形；3)完全培养基培养的第6代乳腺上皮细胞冻存复苏后能快速贴壁并分裂增殖。综上，乳汁分离法成功分离犬乳腺上皮细胞，且与基础培养基相比，完全培养基可以更好地维持细胞活性，促进细胞增殖分裂，且不影响细胞冻存后复苏的活力，为后期快速分离犬乳腺上皮细胞提供较优的培养方案。

　通过有效的细胞培养方法获得了牛乳腺上皮细胞系,并系统观察了乳腺上皮细胞的长出、贴壁、聚集、迁移、分裂、分化、凋亡等一系列形态变化。结果发现,原代培养的乳腺上皮细胞大多数呈卵圆形,细胞之间连接成片,单层生长,如鹅卵石铺过路面,乳腺上皮细胞和成纤维细胞混生时分区生长,界线明显。传代的乳腺上皮细胞呈岛屿状聚集生长,细胞核呈圆形或椭圆形,核仁2～4枚;在含雌激素的培养液中,细胞出现双核或多核现象,但仍表现一定的接触抑制现象。多次传代后的乳腺上皮细胞含不同的细胞类型,通过光镜观察,部分细胞仍保持较快的分裂增殖能力;部分细胞渐渐分化,出现长形细胞、三角形细胞。上皮细胞增殖分化可形成圆顶型结构,乳腺上皮细...

为建立成熟的奶牛乳腺上皮细胞体外培养体系,以组织块种植法培养荷斯坦泌乳期成年母牛乳腺组织,观测长出的上皮细胞在各生长时期的形态变化,绘制生长曲线并计算群体倍增时间,用免疫组化技术鉴定乳腺上皮细胞角蛋白18的表达,用SDS-PAGE电泳和免疫印迹分析技术检测乳腺细胞的酪蛋白分泌情况。试验结果表明,此培养体系可获得良好的奶牛乳腺上皮细胞,原代以及传代培养,细胞增殖旺盛,长势良好;细胞骨架蛋白——角蛋白18表达为阳性,且培养的细胞具有分泌牛乳酪蛋白的功能。

细胞的分离培养是细胞生物学的基础技术,它被广泛应用于细胞生物学、分子生物学和内分泌学等方面的研究。目前常用的奶牛乳腺上皮细胞体外培养方法有酶消化法、组织块培养法、机械破碎法和乳汁分离法等方法。本研究主要综述了奶牛乳腺上皮细胞的体外培养方法、应用情况及发展趋势。

从培养基、细胞接种浓度、冻存液三方面对奶牛乳腺上皮细胞体外培养条件进行了优化。采用台盼兰染色计数方法绘制细胞生长曲线,评定细胞体外生长增殖。结果表明,使用DMEM/F12培养基细胞生长状况最好,DMEM培养的细胞较DMEM/F12生长缓慢,F12其次,RPMI1640培养细胞生长最慢;以1×104的接种浓度于24孔板,细胞生长状态最好,细胞的生长周期经历了潜伏期、对数生长期、稳定期、衰亡期4个生长阶段,生长曲线符合"S"型生长规律;采用胎牛血清(90%FBS+10%DMSO)和培养基(70%培养基+20%FBS+10%DMSO)两种冻存液冻存奶牛乳腺上皮细胞,细胞复苏培养后,胎牛血清冻存的细胞...

【背景】MicroRNAs(miRNA)是一类小RNA分子（18—23nt），广泛参与了家畜乳腺发育和泌乳性能的调控。项目组前期在小尾寒羊上应用RNA-Seq研究发现，miR-221在空怀期乳腺组织中的表达量是泌乳期的3.6倍，但是尚不清楚miR-221对绵羊乳腺发育的调控机制。【目的】探讨miR-221是否通过靶向基因IRS1抑制绵羊乳腺上皮细胞的活力和增殖数量，为揭示miR-221对绵羊泌乳性能的分子调控机理提供理论参考。【方法】采集小尾寒羊乳腺、心脏、肝脏、肾脏、脾脏、肺脏、背最长肌和卵巢等8个组织样本，采用实时荧光定量PCR(reverse transcription-quantitative PCR,RT-qPCR)技术，构建miR-221在绵羊8个组织中的表达谱。采用细胞转染、CCK-8和Edu等方法，研究miR-221对绵羊乳腺上皮细胞活力和增殖的影响。利用miRDB和miRanda数据库，预测miR-221的靶基因，结合功能富集分析，确定目标靶基因，构建靶基因的野生型和突变型载体，进而用双荧光素酶报告实验，验证miR-221与预测靶基因间的靶向关系。分析过表达和沉默miR-221对靶基因及其信号通路下游功能基因的影响。【结果】RT-qPCR结果表明，miR-221在绵羊乳腺等8个组织中均表达，其中在肺脏和脾脏中的表达量最高，在背最长肌和肾脏中的表达量最低。CCK-8结果表明，miR-221模拟物抑制了绵羊乳腺上皮细胞的活力（P<0.01），而miR-221抑制剂提高了乳腺上皮细胞的活力（P<0.05）。Edu试验发现，miR-221模拟物减少了Edu标记的阳性乳腺上皮细胞数量（P<0.01），而miR-221抑制剂增加了Edu标记的阳性乳腺上皮细胞数量（P<0.01），而miR-221抑制剂提高了该基因的活性（P<0.05），表明IRS1是miR-221的一个靶基因。RT-qPCR结果进一步发现，过表达miR-221降低了绵羊乳腺上皮细胞中IRS1和PIK3R1的表达量（P<0.05），沉默miR-221则提高了这2个基因的表达量（P0.05）。【结论】miR-221通过抑制靶基因IRS1的表达量，最终抑制了绵羊乳腺上皮细胞的活力和增殖数量。

为研究山羊小肠上皮细胞营养吸收调控及其与肠道微生物之间的关系,提供原代细胞培养模型,采用组织块接种来获得山羊小肠上皮细胞,利用有限稀释法来克隆山羊小肠上皮细胞,并通过细胞形态学以及细胞角蛋白18、波形蛋白、肌间线蛋白和细胞生长曲线来鉴定山羊小肠上皮细胞。结果表明:1)采用组织块接种能够分离纯化得到山羊小肠上皮细胞并稳定传至大约10代;2)RT-PCR检测发现山羊小肠上皮细胞不能够表达波形蛋白和肌间线蛋白;3)在正置显微镜下观察到山羊小肠上皮细胞能够产生细胞角蛋白18绿色荧光。研究发现,培养至第8代的山羊小

【目的】建立新生山羊肾小管上皮细胞(Renal tubular epithelial cell,RTECs)的分离培养方法。【方法】采集刚出生未哺乳健康山羊的肾脏,分别采用胶原酶Ⅰ和胶原酶Ⅳ消化法分离培养RTECs,选择孔径0.15mm的筛网对RTECs进行纯化,观察各组RTECs的生长情况;对分离的RTECs进行免疫组化和碱性磷酸酶染色鉴定,并进行透射电镜观察;用流式细胞仪检测RTECs的增殖周期和凋亡情况。【结果】胶原酶Ⅳ对RTECs的消化效果优于胶原酶Ⅰ,所得的细胞团块多,纯度高,细胞生长快,经孔径0.15mm的筛网过滤后,RTECs的纯度达95%以上,并可连续传至第12代。分离获得的细...

为了构建HSP72慢病毒表达载体,建立稳定表达HSP72的牛乳腺上皮细胞系。以牛HSP72基因序列为模板,设计并合成引物,PCR扩增目的基因,连接到慢病毒表达质粒中,用包装获得的慢病毒感染牛乳腺上皮细胞,经一定浓度的嘌呤霉素筛选,Hochest33342法对细胞核定位,倒置荧光显微镜下观察转染效率,用免疫组化和Western Blot方法验证感染细胞是否稳定表达HSP72。结果显示,携带HSP72基因的慢病毒滴度约为1. 0×109TU/m L;确定嘌呤霉素的最佳筛选浓度为2μg/m L;牛HSP72慢病毒感染细胞表达HSP72,感染的奶牛乳腺上皮细胞在倒置荧光显微镜下可看到绿色荧光,转染效率可达90%以上;免疫组化结果表明,正常细胞和空载体感染细胞,HSP72呈现低表达,转染携带HSP72目的基因载体细胞,HSP72高表达,呈现颜色较深的棕色; Western Blot方法检测证实与正常转染细胞相比,慢病毒空载体转染的奶牛乳腺上皮细胞HSP72表达稍有降低,但无统计学差异,而携带HSP72基因的慢病毒载体转染的细胞HSP72呈现高表达,且差异极显著(P

用剪切及剪切加胰蛋白酶法消化兔泪腺组织,获取兔泪腺上皮细胞,设计相应的培养基,进行组织块原代培养或混合消化原代培养,用免疫细胞化学染色进行细胞鉴定。结果表明,组织块在体外培养10 d,可见上皮样细胞从植块边缘长出,2周后泪腺上皮细胞在培养瓶底部铺成单层,经传代3次,角蛋白染色阳性细胞纯度达90%以上;用混合消化法接种的细胞生长相对较慢。结果提示:用剪切组织块进行培养的方法简便易行,易获得符合要求的兔泪腺上皮细胞。

为阐明甲状腺素及胰高血糖素对高温体外培养奶牛乳腺上皮细胞内热休克蛋白(HSPs)mRNA转录和蛋白表达的影响。本试验对体外培养的奶牛乳腺上皮细胞添加不同浓度的甲状腺素、胰高血糖素,分别于42℃培养12 h。采用RT-qPCR方法检测细胞内HSF-1、HSP27、HSP70和HSP90的mRNA表达丰度,ELISA方法检测HSP27、HSP70和HSP90的蛋白质表达。各浓度的甲状腺素、胰高血糖素均能显著降低高温条件下奶牛乳腺上皮细胞中HSP27、HSP70和HSP90 mRNA表达丰度(P<0.05);各浓度的胰高血糖素能极显著的降低高温条件下HSP27、HSP70和HSP90的蛋白表达(P<...