为了解猪肺炎支原体流行菌株遗传变异情况,选取2014-2017年不同时间、地点收集的17头猪肺炎支原体阳性屠宰猪肺脏灌洗液DNA为模板,进行猪肺炎支原体P36(编码具有强免疫原性的胞浆蛋白)、P46(编码具有强免疫原性的表面蛋白)、P97 R1区、P146高变区(猪肺炎支原体黏附气管纤毛细胞的重要功能区域)基因的PCR扩增、测序。结合GenBank登录的猪肺炎支原体相关序列进行氨基酸序列的比对分析。结果表明,比对的序列之间,P36、P46蛋白氨基酸序列同源性均在98.9%以上,但P97功能区R1区、P146多变区在菌株间存在较大差异。11个屠宰猪样本和5个GenBank登录菌株P97 R1区重复氨基酸序列数量达到14个以上,而GenBank登录的3个疫苗相关菌株(168株、168-L株、J株)及另外4个菌株、4个屠宰猪样本重复序列为9～11个不等;P146高变区氨基酸序列的差异主要集中在2个重复氨基酸序列区(R1、R2),GenBank登录的168株、168-L株、J株以及另外2个菌株,1个屠宰猪样本在R1区出现较多氨基酸缺失。168株、168-L株,6个屠宰猪样本及另外3个GenBank登录菌株在R2区出现了3～9个不等的氨基酸缺失。利用DNAStar进行抗原表位预测发现,菌株间P97 R1、P146 R1、P146 R2区氨基酸序列的差异,导致了抗原表位出现明显的变化。提示开展P97、P146等黏附因子的筛选和研究或许能进一步提升疫苗阻止猪肺炎支原体黏附气管纤毛细胞的作用,从而进一步改善疫苗的免疫效果。

本研究对新疆沙湾县疑似绵羊肺炎支原体(MO)感染的病料进行病原的分离鉴定,并对分离株进行形态学、生化和分子生物学鉴定。分离鉴定出MO13株,提取MO分离株的基因组,经PCR技术扩增MO分离株膜蛋白P80基因,将扩增序列与Gen Bank中已知的MO法国14811株膜蛋白P80基因序列进行比较。结果表明,该序列核苷酸的同源性为97.11%,推导氨基酸序列的同源性达到98.28%。该基因存在60处碱基突变,其中24处是同义突变,36处为错义突变,表明MO不同地域分离株膜蛋白P80存在一定的遗传变异。

为了分析绵羊肺炎支原体（ＭＯ）膜蛋白ｐ５６的反应原性，本研究以ＭＯ新疆流行株为模板，设计特异性引物对ｐ５６抗原集中区段进行ｐＣＲ扩增，将扩增产物克隆测序，进一步亚克隆至表达载体ｐＥＴ－２８ａ（＋）中，构建ｐＥＴ－２８ａ（＋）－ｐ５６原核表达载体。将重组载体转化至大肠杆菌ＢＬ２１（ＤＥ３）感受态细胞中，用ＩｐＴＧ对重组菌进行诱导，ＳＤＳ－ｐａＧＥ和ＷＥＳＴＥＲｎ ＢＬＯＴ分析表达产物。结果表明，ＳＤＳ－ｐａＧＥ分析证实表达的重组融合蛋白相对分子量为４４ ｋＤａ；ＷＥＳＴＥＲｎ ＢＬＯＴ分析表明该重组蛋白可与ＭＯ阳性血清发生特异性免疫学反应，证实表达的重组ｐ５６融合蛋白具有良好的反应原性，为进一步．．．

【方法】利用PCR方法对绵羊肺炎支原体(Mycoplasma ovipneumoniae,MO)新疆分离株MO-XJ p74基因进行扩增、克隆及测序,分析其分子特征。将P74蛋白抗原集中区编码序列亚克隆至表达载体p ET-32a(+),构建重组表达载体p ET-32a(+)-p74C,转化至E.coli BL21(DE3)感受态细胞中,IPTG诱导表达。【结果】MO-XJ p74基因全长2016 bp,编码671个氨基酸;对编码的氨基酸序列分析发现,该蛋白不含信号肽序列,931位氨基酸序列含有1个跨膜区,

【目的】构建绵羊肺炎支原体(MO)p74基因重组单核细胞增生李斯特菌(LM)并分析其免疫原性,为研发MO重组活疫苗奠定基础。【方法】采用PCR方法从LM-SB5株基因组中扩增出rli60基因的上、下游同源片段a和b,从质粒pET-32a(+)-p74中扩增出MOp74目的基因片段,利用重叠延伸PCR方法(SOE-PCR)将扩增的3个片段融合成ap74b基因片段,克隆入pMD19-T载体中进行测序鉴定。将ap74b片段从pMD19-T载体上切下亚克隆入pKSV7穿梭载体,构建pKSV7-ap74b重组穿梭质

【背景】猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae,Mhp)通过定植猪呼吸道黏膜层，破坏呼吸道炎性反应平衡，引起炎性损伤和持续性感染。短的上腭、肺及鼻咽上皮克隆1蛋白(short palate lung and nasal epithelial clone1,SPLUNC1)是呼吸道黏膜分泌的具有重要抗菌和抗炎功能的蛋白，被认为是呼吸道黏膜面对危险信号时的“信号传感器”。【目的】从Mhp和SPLUNC1相互作用入手，分析Mhp感染对SPLUNC1表达的影响以及SPLUNC1对Mhp引起的炎性反应的调控作用，揭示Mhp引起炎性损伤的新机制，为解决Mhp持续性感染问题提供参考。【方法】利用猪肺炎支原体对猪支气管上皮细胞（porcine bronchial epithelial cells,PBECs）感染模型和猪体感染模型，通过荧光定量PCR、间接免疫荧光和Western-blotting等方法，分别检测Mhp感染后对肺脏中SPLUNC1以及体外PBECs中SPLUNC1转录和表达的影响。克隆并扩增猪源SPLUNC1基因通过酶切鉴定，构建成功SPLUNC1真核和原核表达重组质粒pCDNA3.1-SPLUNC1以及pET28a-SPLUNC1。与此同时，设计靶向SPLUNC1的siRNA干扰片段。利用体外SPLUNC1蛋白孵育、体内呼吸道黏膜SPLUNC1抗体封闭，通过Mhp CCU50检测明确SPLUNC1对Mhp体内外生长的影响。在猪支气管上皮细胞中，通过过表达或siRNA干扰SPLUNC1基因，后感染Mhp，利用Western-blotting、间接免疫荧光以及酶联免疫吸附方法，明确SPLUNC1对Mhp的黏附作用、诱导炎性因子表达以及MAPK信号通路活化的影响。【结果】Mhp感染猪后可引起肺脏实变，主要组织病理表现为肺脏炎性损伤，同时显著上调肺泡灌洗液中趋化因子CXCL8和炎性因子TNFα和IL-1β分泌。Mhp体内外感染后，体内肺脏和体外猪支气管上皮细胞中SPLUNC1的转录和表达均显著下调。以上研究表明，Mhp可诱导肺脏炎性反应，抑制SPLUNC1表达。另一方面，体外PBECs中过表达SPLUNC1后，Mhp感染引起的CXCL8表达显著减少；siRNA干扰SPLUNC1后，Mhp感染引起的CXCL8表达显著增加，表明SPLUNC1负调控Mhp感染引起的CXCL8表达。基于Mhp感染入侵呼吸道过程，本研究进一步解析SPLUNC1负调控CXCL8表达的机制。结果表明：无论是SPLUNC1和Mhp体外孵育，还是SPLUNC1抗体体内封闭，Mhp的体内外生长均未受影响；SPLUNC1的过表达或siRNA干扰对Mhp体外黏附PBECs的能力也无显著影响；过表达SPLUNC1可抑制pERK和IκBα的激活，相反SPLUNC1 siRNA干扰后，可促进pERK和IκBα的激活。以上研究证明SPLUNC1不是通过调控Mhp的生长和黏附，而是通过负调控MAPK-ERK通路的活化来调控CXCL8的表达。【结论】SPLUNC1可通过MAPK-ERK信号通路来调控炎性因子的过度表达，维护宿主炎性平衡；与此同时，Mhp感染后可通过抑制SPLUNC1的表达来破坏宿主炎性反应的平衡调控，进而引起炎性损伤。本研究为解析Mhp感染损伤机制提供依据。

【目的】检测并验证猪支原体肺炎发生的品种敏感差异,筛选相关差异表达基因,探究猪支原体肺炎发生的分子遗传基础,为猪该病发生的分子机制研究提供依据。【方法】以对肺炎支原体易感的梅山猪、耐受的长白猪及二者杂交选育的苏钟猪为材料,设立试验组(15头/品种)和对照组(5头/品种),试验组猪接种肺炎支原体Js强毒株,对照组猪注射等量生理盐水,所有猪隔离、无抗生素饲养,监测临床表现;处理后18、28 d测定日增重、抗体水平及肺部病变,28d试验结束时集中屠宰,评定肺部损伤,检测病原,确定肺炎支原体感染情况;选择肺炎支原体感染的梅山、长白、苏钟猪各2头,未感染猪各2头,构成芯片杂交试验猪群,应用Agilent...

LFY(LEAFY)及其同源基因是控制高等植物从营养生长向生殖生长转变的重要基因,对这些基因进行深入研究具有缩短林木幼龄期和改良花卉花期的实际应用价值。为了深入研究LFY氨基酸序列变化对其功能的影响,本研究以lfy2和lfy5为材料分析了这2个突变体表型变异及突变位点的特点。表型观察表明:虽然lfy2和lfy5属于不同的生态型,但是表型变异类似;lfy突变体花期比野生型推迟14d,茎生叶和次生枝的数目增多,花器官缺失并且被同源异型化。序列分析发现:lfy2的LFY氨基酸序列中只发生了P236L位点变异,lfy5的LFY氨基酸序列中发生变异的位点为F42L、V209A和P236L,其中F42L和...

【目的】确定猪体内存在与猪圆环病毒2型核苷酸序列高度同源的因子。【方法】首先利用PCR方法对来自临床表现为猪断奶后多系统衰竭综合征的猪血清所抽提的DNA进行扩增,根据获得的序列再设计引物进行反向PCR,拼接得到类猪圆环病毒2型因子P1的全基因组序列,最后根据P1全基因组序列设计引物扩增其全基因组加以验证。【结果】首次完成了类猪圆环病毒2型因子P1的全基因组序列测定。测序结果表明P1因子为环状DNA基因组,全长648个核苷酸,包括3个开放阅读框。除5′端16个核苷酸外,P1因子与国内猪圆环病毒2型BF毒株的核苷酸同源率为98.42%。系统进化分析表明P1与猪圆环病毒有很近的亲缘关系。【结论】猪体...

【目的】本研究通过对不同PVY分离物基因的测序及分析,了解青海省PVY株系特点,进而对PVY病毒的分子检测和预防控制提供理论基础。【方法】采用RT-PCR扩增的方法,对青海省18个PVY的P1基因进行克隆测序和进化树分析。【结果】P1目的基因共825个碱基,编码275个氨基酸;经比对样品的P1基因序列,核酸一致率达90.3%～100.0%,其中Y-39、Y-47和Y-513个样品与其它样品有55～61个碱基的差异;试验样品与国内外已报道的PVY P1基因相比较,经进化树分组后,主要分为A、B、C 3组,其中A组包含了大部分来自青海的样品,是本地区的优势组群;而另一组4个样品的P1基因与本地优势组群有较大差异,且4个样品间也有一定的差异。通过与GeneBank中已上传的序列提供的信息相比对,发现14个样品的P1基因与PVY~(N-Wi)株系较近;其余4个样品与PVP~(NTN)株系较近。【结论】由P1基因分析表明,青海省马铃薯Y病毒株系具有地域特点,另外的4个样品说明青海PVY有可能是不同区域间种薯调运以及PVY本身重组特性而产生的。

为丰富柞蚕核型多角体病毒分子生物学基础,通过PCR扩增克隆了ApNPVp11基因并进行了序列的生物信息学分析。ApNPVp11基因编码102个氨基酸,预测分子量11.2 kDa;氨基酸序列N端1~33位是信号肽序列,中部50~72位是跨膜区。PSI-BLAST搜索表明有20种核型多角体病毒编码蛋白与ApNPV P11蛋白有显著性匹配;比对分析发现P11蛋白氨基酸序列中部相对保守,两端变异较大。进化分析表明ApNPV属于NPV类群I且与EppoNPV、AgMNPV、CfDefNPV亲缘关系较近。

为了探讨野猪与家猪杂交生产野杂种猪的可能性 ,通过野猪与家猪杂交所产的一代野杂种猪的饲养和肥育试验 ,对野杂种猪的饲养管理和肥育屠宰性能进行了分析测定。结果表明 ,野杂种猪耐粗饲 ,背膘厚度明显低于当地家猪 ,但生长速度较慢

本研究克隆了仿刺参(Apostichopus japonicus)P450c17基因的全长cDNA,结果表明其cDNA的5′端UTR为256 bp,3′端UTR为250 bp,ORF为1 530 bp。在3′端有特殊序列ATTTA、终止密码子TAA和polyA加尾。其全长cDNA编码509个氨基酸的前体蛋白,预测蛋白分子量57.6 kD,理论等电点5.5。P450c17的氨基酸序列存在长度为25个氨基酸的信号肽,1个长度为22个氨基酸的跨膜区,1个糖基结合位点NHS,1个P450特有的结构域,其氨基酸序列具有明显的细胞色素P450基因家族的特征。结构域中亚铁血红素结合域中的精氨酸R和发挥活性所...

【背景】流感病毒的抗原性主要是由病毒的表面糖蛋白HA决定的，前期利用欧亚类禽型H1N1猪流感病毒（EA H1N1 SIV）HA蛋白单克隆抗体（mAb）筛选抗原逃逸株发现，HA蛋白190、230和269位（H3编码）氨基酸的改变能够导致病毒发生抗原逃逸，并发现在新近分离的EA H1N1 SIV HA蛋白广泛存在这3个氨基酸的变异。【目的】进一步探索哪些氨基酸对病毒的抗原性具有关键作用，为流感的防控提供科学依据。【方法】选取一株病毒A/swine/Liaoning/SY72/2018(H1N1) SY72为模式病毒，建立该病毒的反向遗传系统（RGS），又以SY72为骨架，拯救含有HA基因190、230和269单点突变重组病毒；利用rSY72病毒制备灭活疫苗，分别免疫SPF鸡和非免疫猪制备其相应的血清，通过中和试验和血凝抑制（HI）试验分析病毒的抗原性，确定影响病毒抗原性的关键氨基酸位点；继而评估HA蛋白不同位点氨基酸的改变对病毒复制特性及受体结合特性等的影响。【结果】分析SY72病毒的HA氨基酸序列发现，该病毒HA蛋白分别含有190D、230M和269R。利用反向遗传技术，分别拯救了病毒rSY72及单点突变病毒rSY72HA/D190N、rSY72HA/M230I和rSY72HA/R269M；中和试验结果表明，与rSY72相比较，3株突变病毒均能够与两株mAbs发生一定反应；HI试验结果显示，与rSY72相比较，突变病毒rSY72HA/D190N与rSY72免疫鸡血清和猪血清的反应减弱，HI抗体效价分别出现了4倍和8倍的差异，而病毒rSY72HA/M230I和rSY72HA/R269M与两种血清的反应差异不明显，表明HA蛋白190位氨基酸改变对病毒的抗原性影响最为明显；病毒蚀斑测定及复制动力学研究结果发现D190N的氨基酸替换导致病毒rSY72HA/D190N在MDCK细胞上形成的蚀斑减小，而R269M的氨基酸替换导致病毒rSY72HA/R269M在MDCK细胞上的复制能力下降；3个位点的氨基酸替换均未影响病毒的受体结合特性。【结论】HA蛋白190位氨基酸对EA H1N1 SIV抗原性具有决定作用，269位氨基酸突变使得病毒在MDCK细胞上的复制能力降低。这提示在后续开展的病原学监测中要密切关注这些氨基酸的变异情况，提高对动物流感的预警预报。

为了分析绵羊ＫＡＰ１１－１基因的核苷酸序列变异，采用ＰＣＲ－ＳＳＣＰ方法和ＤＮＡ测序技术检测了欧拉羊、甘肃高山细毛羊、滩羊、湖羊和青海细毛羊５个群体（７４９只个体）ＫＡＰ１１－１基因的单核苷酸多态性，同时分析了等位基因频率、遗传杂合度、有效等位基因数和多态信息含量等群体遗传特征。结果表明，５个绵羊群体的ＫＡＰ１１－１基因中共检测到Ｃ．９３Ｃ／Ｔ、Ｃ．２４０Ｇ／Ａ、Ｃ．２８５Ｃ／Ｇ／Ａ和Ｃ．３３１Ａ／Ｇ ４个单核苷酸多态位点，且Ｃ．３３１Ａ／Ｇ为非同义突变。等位基因Ａ在５个群体中出现的频率最高（８７．７０％），为优势等位基因，其次为等位基因Ｂ（基因频率为１１．０３％），等位基因Ｃ和Ｄ的频率最低（．．．