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[期刊] 上海水产大学学报
[作者]
何学军 李思发
用Stratagene技术构建了吉富品系尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus,GIFT strain)肝cDNA文库。首先用TRIZOL法提取肝总RNA,经琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度检测,表明总RNA纯度高且完整性良好。然后分离纯化mRNA,合成双链cDNA之后,加EcoRⅠ接头、EcoRⅠ末端磷酸化、XhoⅠ消化,并用葡聚糖凝胶柱层析分级收集cDNA样品,得到300 mg cDNA,符合建库要求。双链cDNA与Uni-ZAP XR Vector连接后,用GigapackⅢGold Packaging Extract进行体外包装得到cDNA文库。测得的文库滴度为1.25×1...
关键词：
尼罗罗非鱼 肝 cDNA文库
[期刊] 西南农业学报
[作者]
陈明 李超 王瑞 李莉萍 甘西 余晓丽 雷爱莹 黄婷 陈福艳 梁万文
为大规模快速克隆罗非鱼细胞免疫功能基因,采用SMART技术,构建了尼罗罗非鱼链球菌疫苗免疫后外周血白细胞全长cDNA文库。提取免疫后第3、5和7天外周血白细胞总RNA,用PowerscripTM反转录酶逆转录合成第一链cDNA,LD-PCR扩增获得双链cDNA,经SfiI酶切和CHROMASPIN-400TM柱分级分离,收集500 bp以上的片段重组于改造的pBluescript II SK载体并转化大肠杆菌DH5α,测定文库滴度、重组率及库容量。结果表明,构建的cDNA文库原始库容量1.021×106克隆,文库滴度1.078×106pfu/mL,重组率94.71%,插入片段大小0.75~3....
[期刊] 中国水产科学
[作者]
刘坡 李凯彬 王芳 刘春 聂湘平 吴淑勤
以暴露于β-萘黄酮(beta-Naphthoflavone,β-NF)中的剑尾鱼(Xiphophorus helleri)为研究对象,采用SMARTTM(Switching Mechanism At 5' end of RNA Transcript)技术,成功构建了剑尾鱼肝脏cDNA文库。该文库约含有4.2×107个重组子,重组效率达l00%,插入片段多在0.6～2.5kb之间,平均插入片段长度约1.3kb,扩增后文库滴度为7.0×109CFU/mL。随机挑取200个重组子进行测序检验,共得到长度大于500bp的Expression sequence tag(EST)序列187个,对所测EST...
关键词：
剑尾鱼 肝脏 cDNA文库
[期刊] 淡水渔业
[作者]
耿青 肖炜 李大宇 邹芝英 祝璟琳 杨弘
以尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)为对象,采用体内注射植物血细胞凝集素(PHA)方式收集有丝分裂后期的鱼体头肾细胞,低渗法制片,运用激光显微分离获得尼罗罗非鱼1号染色体,分离后的单染色体通过特异性酶切和LA-PCR体外扩增,得到500~2 000 bp之间的DNA片段,并通过Southern blot和微卫星标记得到验证。扩增片段通过电泳回收、连接转化、感受态细胞培养等步骤构建尼罗罗非鱼1号染色体微克隆文库,克隆片段长度在300~600 bp之间。
[期刊] 水产学报
[作者]
李明辉 吴风瑞 熊传奇 曾圣 杨世杰 叶凯 蒋汶洮 孙运侣 黄宝锋 魏莹莹 焦静 顾源 王德寿
以pCC2FOS为载体构建尼罗罗非鱼Fosmid基因组文库,共挑选115 200个单菌落,保存在300块384孔样品板中,构建4 800个行池、7 200个列池、300个板池和25个超级池,形成微阵列,并对其进行复制备份。该文库插入片段平均长度约为40 kb,覆盖约罗非鱼基因组的3倍。连续传代实验研究表明,文库具有良好的稳定性。由于构建超级池-板池-行、列池三级池系统形成的微阵列,有助于快速、准确、有效地筛选目的基因,仅需77个PCR反应(超级池25+板池12+行池16+列池24)就能筛选到含有目的基因的一个单克隆,解决了普遍存在的文库筛选难题。通过文库尝试筛选18个与性别分化和生长相关基因,...
关键词：
尼罗罗非鱼 基因组文库 微阵列 基因筛选
[期刊] 中国水产科学
[作者]
马细兰 张勇 刘晓春 林浩然
选取同一批30日龄的尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)鱼苗置于水泥池中自然饲养,分别于30、60、80、110、140日龄取样测定不同发育阶段雄鱼的特定生长率。用实时荧光定量PCR方法检测雄鱼肝脏中两种生长激素受体(GHR1和GHR2)的mRNA丰度。结果表明,30～110日龄,雄鱼特定生长率呈不断上升趋势,至80～110日龄达到最高,之后开始下降;雄鱼肝脏中2种GHR基因表达的发育性变化趋势不相同,30～110日龄,GHR1mRNA表达逐渐上升,110日龄达到最高,随后开始下降,其发育性变化与特定生长率显著正相关(R=0.96,P<0.01);GHR2mRNA表达在60...
[期刊] 中国水产科学
[作者]
宋凌元 程亚美 赵金良
为探讨盐度胁迫对尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)肝脂肪酸代谢的影响，本研究分别在盐度8和盐度16的水体中对尼罗罗非鱼进行两周的胁迫实验，比较盐度胁迫过程中肝脂肪酸组成变化，以及脂蛋白脂肪酶(lipoprotein lipase, LPL)、苹果酸酶(malic enzyme, ME)和过氧化物酶体增殖物激活受体α亚基(peroxisome proliferator-activated receptor, PPAR-α) mRNA表达量变化。结果表明，胁迫12 h，盐度组血浆渗透压升至最高，16盐度组血浆渗透压显著高于8盐度组(P<0.05)，而长链多不饱和脂肪酸(DHA、EPA和ARA为主)含量显著高于淡水组(P<0.05)。盐度组脂蛋白脂肪酶酶(LPL)、苹果酸酶(ME)、过氧化物酶体增殖物激活受体α亚基(PPAR-α)mRNA表达量均显著高于淡水组(P<0.05)。结果表明，盐度胁迫影响了肝脂肪酸组成和脂代谢过程。本研究旨在为鱼类渗透调节中脂类能量利用提供基础资料。
关键词：
尼罗罗非鱼 脂肪酸 脂代谢 盐度胁迫
[期刊] 西南农业学报
[作者]
李超 陈明 李莉萍 黄维义 余晓丽 黄婷 张彬 雷爱莹 陈福艳 梁万文
为筛选罗非鱼链球菌疫苗免疫前后白细胞表达变化基因及探讨鱼类白细胞免疫机理,利用抑制性差减杂交(SSH)技术,以链球菌疫苗免疫前后罗非鱼白细胞cDNA为材料,构建了罗非鱼免疫前后正、负2个cDNA差减文库,并采用地高辛(DIG)标记差减文库cDNA作为探针,进行差异表达片段的筛选鉴定。结果显示:2个文库重组率均在90%以上,插入片段在300～900 bp,接头连接效率超过50%,差减效率非常高效,阳性率均超过70%。杂交筛选后正、负文库各挑选30个阳性克隆进行测序组装聚类,正、负文库各获得16和18条非冗余EST(unigene),所得序列经GenBank同源性分析,正、负文库各有10和11条u...
[期刊] 中国水产科学
[作者]
汪登强 罗晓松 陈大庆
采用CloneMinerTMcDNA文库构建试剂盒构建了患败血症的鲢(Hypophthalmichthys molitrix)肝和肾的cDNA文库。经检验,文库的滴度为1.34×107 cfu/mL,总库容为2.68×107 cfu,阳性克隆率为97.5%,平均插入片段大于1.2 kb。对80个随机挑选的克隆进行两端测序,结果显示有74个测序成功。经在GenBank上BLAST比对,其中57个为已知功能基因,属于45个不同基因,另外17个没有明显的同源序列。在已知功能的57个克隆中,含有全长编码区序列的克隆共有49个,全长cDNA比率为61.25%。采用PCR法对文库进行筛选,获得一个含MHC...
关键词：
鲢 cDNA文库 MHC 肝 肾
[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
胡建 戴华国 符文俊
从寄生在亚洲玉米螟 (Ostriniafurnacalis)幼虫体内 6d的腰带长体茧蜂 (Macrocentruscingulum)胚胎中提取总RNA和mRNA ,用分离到的微量mRNA合成cDNA第 1链。通过长距离PCR扩增得到足够量的双链cDNA。将SfiⅠ酶切后并纯化的cDNA片段连接到经SfiⅠ酶切的噬菌体λTripIEX2上 ,并对噬菌体进行包装 ,建成cDNA的全长库。经大肠杆菌XL1 Blue平板检测 ,未扩增文库的滴度为 0 75× 10 6pfu·mL-1,克隆重组百分率为 96 77% ,扩增后文库的滴度为 0 5×10 10 pfu·mL-1。
[期刊] 华北农学报
[作者]
郭九峰 孙国琴 沈传进 乔惠蕾 贾利敏 郭志杰
为研究沙冬青抗逆的分子机理,分离克隆其抗逆基因,以pBluescript II SK为载体构建了沙冬青(Ammopip-tanthus mongolicus)越冬叶片cDNA文库,并对文库的部分克隆进行了5'端随机测序,结果表明,该文库容量为2.16×105cfu,重组率为89.6%;插入片段的平均长度大于1 kb。随机测序得到542个EST,拼接成360个uniEST,经网上BlastN及BlastX分析,其中313个是已知功能的基因的标签,包括能量代谢、物质转化、细胞生长等生物过程,其中与抗逆相关的48条。
关键词：
沙冬青 cDNA文库 表达序列标签
[期刊] 北京林业大学学报
[作者]
李晓颖 曹雪 杨光 王晨 沈玉英 房经贵
以果梅品种'细叶青'不同时期的花和果实为实验材料,应用Creator SMART cDNA Construction Kit构建了我国果梅第一个花和果实的cDNA文库。结果表明,该文库的库容量约为1.4×106pfumL,从扩增文库中随机挑取30个克隆进行PCR鉴定,其重组率达97%,插入片段多分布在1～3kb之间,平均大于1kb。说明本研究成功构建了果梅花和果实的cDNA文库,为进一步开展果梅开花调控和果实发育等相关基因的克隆及其表达与功能分析等研究奠定了重要基础。
关键词：
果梅 果实 花 cDNA文库 RNA提取
[期刊] 上海水产大学学报
[作者]
刘士成 杜道海 张成武 周志刚
缺刻缘绿藻(Myrmecia incise)富含花生四烯酸(arachidonic acid,AA),是迄今为止所知道的花生四烯酸含量最高的藻类。采用Trizol法提取总RNA,然后按照Clontech公司的SMART cDNA文库构建的方法,构建了缺刻缘绿藻的cDNA文库,测得的原始文库滴度为6×106pfu/mL,随机挑选文库的阳性单克隆进行PCR鉴定,扩增出的片段主要集中在0.5~1.5kb,平均插入片段长度约为1kb,文库的重组率达95.83%,说明本实验所构建的cDNA文库质量合格。
关键词：
缺刻缘绿藻 cDNA文库 花生四烯酸
[期刊] 水产学报
[作者]
肖调义 葛熹凯 许宝红 苏建明 章怀云
采用抑制性消减杂交技术构建了三角帆蚌肝脏瘟病感染期抑制性消减cDNA文库。经检验,差异表达基因均被富集了210倍左右,证明构建的cDNA消减文库具有很强的消减效率。PCR鉴定发现,在随机挑取的阳性克隆中,95%的克隆均含有0.2~1.0 kb的插入片段,这些片段可能是三角帆蚌瘟病病毒感染后差异表达基因的cDNA片段。测序共获得214个有效cDNA序列,分别属于8大类,共98个基因。其中细胞分裂基因2个、细胞结构与运动基因9个、代谢基因10个、信号传导基因7个、细胞防疫基因10个、基因与蛋白表达基因20个、未知功能蛋白基因26个,GenBank中找不到任何同源序列的基因14个。结果说明,构建的差...
[期刊] 中国水产科学
[作者]
王艺磊 张子平 戴军 邹志华 王淑红
采用RDP试剂提取杂色鲍(Haliotisdiversicolor)不同免疫时相肝脏的总RNA,经Oligotex试剂盒纯化得到mR NA。根据SMART(switchingmechanismat5′endofRNAtranscript)原理,利用含sfiIB酶切位点的Oligo(dT)引物合成cDNA第1条链,利用含sfiIA酶切位点的SMARTⅢ寡核苷酸作为cDNA第1条链在mRNA5′端延伸出去的模板,采用LD-PCR引物合成双链cDNA。双链cDNA用sfiI酶切和过柱分级分离后,与λTripEx2两臂进行连接,随后进行λ噬菌体体外包装反应,构建成杂色鲍不同免疫时相(12h和24h)全...
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