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[期刊] 水产学报
[作者]
李明辉 吴风瑞 熊传奇 曾圣 杨世杰 叶凯 蒋汶洮 孙运侣 黄宝锋 魏莹莹 焦静 顾源 王德寿
以pCC2FOS为载体构建尼罗罗非鱼Fosmid基因组文库,共挑选115 200个单菌落,保存在300块384孔样品板中,构建4 800个行池、7 200个列池、300个板池和25个超级池,形成微阵列,并对其进行复制备份。该文库插入片段平均长度约为40 kb,覆盖约罗非鱼基因组的3倍。连续传代实验研究表明,文库具有良好的稳定性。由于构建超级池-板池-行、列池三级池系统形成的微阵列,有助于快速、准确、有效地筛选目的基因,仅需77个PCR反应(超级池25+板池12+行池16+列池24)就能筛选到含有目的基因的一个单克隆,解决了普遍存在的文库筛选难题。通过文库尝试筛选18个与性别分化和生长相关基因,...
关键词：
尼罗罗非鱼 基因组文库 微阵列 基因筛选
[期刊] 水产学报
[作者]
茅云翔 崔菁菁 孔凡娜
高分子量基因组文库是开展条斑紫菜基因组学研究的必备工具。构建了由23 040个Fosmid克隆组成的条斑紫菜孢子体无偏倚基因组文库。检测分析表明:文库克隆重组率为100%;插入DNA片段长度为28~40kb,平均长度为35kb,文库覆盖率约为条斑紫菜基因组的2.78倍;从超级池中筛查条斑紫菜18S rRNA、atpA、h2A、rbcL基因,至少能得到一个阳性克隆,印证了计算所推测的文库覆盖率;随机选取6个Fosmid克隆经100代传代后插入DNA片段未发生丢失或长度变化,表明克隆传代的稳定性。该文库的构建为开展条斑紫菜基因组特性分析和基因克隆奠定了基础。
[期刊] 华北农学报
[作者]
李昂 吴志明 周志林 赵冬兰 张安 马代夫 李亚栋 唐君 曹清河
为挖掘有价值的基因资源,对甘薯近缘种I.trifida的基因组文库进行了研究。通过流式细胞法测定I.trifida(2x,编号DLP4597)基因组大小为531.699 Mb。以叶片为材料采用包埋法提取基因组DNA,通过物理剪切进行基因组DNA片段化并进行末端平滑化和磷酸化处理,脉冲场电泳回收33~48 kb的DNA片段,然后连接到Fosmid载体pCC1FOS(Epicentre)上,包装转化大肠杆菌EPI300,构建了I.trifida的基因组Fosmid文库,该文库包含101 952个单克隆,保存于1 062个96孔培养板中,平均插入片段35 kb,覆盖基因组约6.7倍,理论上任意片段筛...
[期刊] 中国农业大学学报
[作者]
段嘉 程功 胡永飞 李晶 律娜 朱宝利
利用宏基因组学方法,以人肠道微生物样品为原材料,构建了1个约30 000个克隆的fosmid文库。以三丁酸甘油酯为底物,通过功能筛选,获得1个酯解酶阳性克隆。对该阳性克隆构建亚克隆,挑选具有酯解酶活性的阳性亚克隆进行测序分析,最终获得1个肠道微生物来源的酯解酶基因(GenBank登录号:JQ972699)。结果表明,文库克隆的平均插入片段约为40kb,没有重复插入片段克隆。获得的酯解酶基因推演蛋白与Pyramidobacterpiscolens W5455的patatin样磷脂酶同源性最高,氨基酸一致性为95%。生物信息学分析结果表明该基因可能通过Vd型分泌方式进行分泌并发挥功能。本研究是通过...
[期刊] 上海海洋大学学报
[作者]
毛瑞鑫 鲁翠云 刘福军 赵莹莹 谷晶晶 常玉梅 梁利群 孙效文
利用磁珠富集和放射性杂交相结合构建了中华绒螯蟹基因组微卫星文库。并利用生物素标记的(GA)12探针进行微卫星片段的富集。将得到的片段与pGEM-T载体连接后转入DH5α大肠杆菌中,然后利用γ-32P同位素标记的(GA)12探针进行第二次筛选。结果共获得微卫星基因组文库1 500个菌,杂交前菌落PCR检测阳性克隆率为62.5(;杂交后得到的阳性克隆为447个,占29.8(。经测序,有248个克隆含有重复次数大于5次的微卫星序列。在得到的微卫星序列中,重复单元除GA/CT外,还观察到三碱基、四碱基重复单元。根据侧翼序列设计引物164对,选择合成50对,通过优化PCR反应条件,结果有21对引物可扩增...
关键词：
中华绒螯蟹 微卫星 磁珠富集
[期刊] 华北农学报
[作者]
王冰林 柳俊 李媛媛 谢从华
应用马铃薯晚疫病水平抗性相关的1 009条表达序列标签(ESTs)所制备的cDNA微阵列和荧光信号Cy3,Cy5杂交系统,通过同一样品RNA的自身比较试验及与不同样品RNA的差异分析试验,对该技术的重复性和可靠性进行了验证分析。结果表明,在自身比较试验中,芯片杂交的假阳性率仅为0.79%,相关系数高达0.981 1;在差异分析试验中,同向标记、正反向标记、同一芯片内2个重复杂交结果的相关系数分别为0.966 0,0.889 5,0.980 2。研究结果证实,cDNA芯片技术具有高度的可靠性,可以鉴定出显著差异表达基因,并构建高质量的基因表达数据库,通过3次生物学重复和2次技术重复试验(采用正、...
关键词：
cDNA微阵列 差异表达基因 可靠性
[期刊] 中国农业科学
[作者]
高世强 张新建 吴茂森 何晨阳
DNA微阵列技术是近年来发展起来的一种功能基因组学研究技术。随着这项新技术的建立和日趋完善及其在植物病理学研究中的应用,为病原细菌致病机理的研究带来了新思路并开辟了新途径。利用DNA微阵列技术,检测病原细菌在不同生长条件下和在侵染植物过程中的基因转录谱,可以从基因组水平上鉴定出新的与毒性和适应性相关的基因及其表达调控网络,有助于阐明这些基因的生物学功能及其机理。本文结合本实验室近几年来的相关研究结果,综述DNA微阵列技术在病原细菌转录谱研究中应用的最新进展。
[期刊] 华中农业大学学报
[作者]
吕作舟 马爱民 杨新美
本文采用原生质体裂解法制备高分子量平菇总DNA。通过Sau 3A部分酶切和蔗糖密度梯度离心,获得15—26kb平菇总DNA酶切片段。并以Lambda的衍生物EMBL3为载体,酶连形成重组DNA。然后将其包装,转染受体菌LE392,在TB平板上获得2.5×10~4个重组子克隆。此重组子克隆群即构成中蔬10号平菇基因组文库。
[期刊] 上海水产大学学报
[作者]
何学军 李思发
用Stratagene技术构建了吉富品系尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus,GIFT strain)肝cDNA文库。首先用TRIZOL法提取肝总RNA,经琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度检测,表明总RNA纯度高且完整性良好。然后分离纯化mRNA,合成双链cDNA之后,加EcoRⅠ接头、EcoRⅠ末端磷酸化、XhoⅠ消化,并用葡聚糖凝胶柱层析分级收集cDNA样品,得到300 mg cDNA,符合建库要求。双链cDNA与Uni-ZAP XR Vector连接后,用GigapackⅢGold Packaging Extract进行体外包装得到cDNA文库。测得的文库滴度为1.25×1...
关键词：
尼罗罗非鱼 肝 cDNA文库
[期刊] 水产学报
[作者]
许玉德 许莉 钟建兴
采用RAPD技术 ,用 2 0个随机引物对尼罗罗非鱼、奥利亚罗非鱼及其杂交一代的精巢DNA进行扩增反应 ,发现引物OPZ - 14和OPZ - 18在尼罗罗非鱼和奥利亚罗非鱼之间扩增出有差异的DNA片段 ,作为鉴定两种鱼的分子标记有较高可信度。对这两种鱼的杂交一代基因组DNA的RAPD扩增能获得足够的多态性 ,2 0个引物中有 8个引物扩增出差异性产物 ,表明杂交一代基因杂合性增强 ,这是杂种优势得以形成的重要遗传物质基础之一。
[期刊] 华中农业大学学报
[作者]
杨丽鸳 朱梦奕 何璟
为了探讨硫藤黄链霉菌中可能存在的次级代谢产物合成及调控机制，以链霉菌整合型质粒ｐＪＴＵ２５５４为载体，构建了硫藤黄链霉菌的基因组表达文库。以模式菌株变铅青链霉菌为异源表达宿主，通过生物活性筛选获得９株具有抑菌活性的异源表达突变菌株，同时通过ｐＣＲ筛选获得多个含有聚酮合酶和非核糖体多肽合成酶基因的克隆子。ＴＬＣ及ＨｐＬＣ－ＭＳ分析发现６个携带有ａＵＲｅｏＴＨｉｎ生物合成基因簇的ＣｏＳＭｉｄ，通过异源表达在变铅青链霉菌中成功合成聚酮类抗生素ａＵＲｅｏＴＨｉｎ，证实文库异源表达及筛选的有效性。
[期刊] 华中农业大学学报
[作者]
赵英杰 吕品 周祥山 张元兴
为研究家驴基因组重复序列,通过2次羟基磷灰石柱层析,分离纯化家驴Cot 0-Cot 0.1之间的基因组高度重复DNA序列,用于构建家驴基因组Cot文库,并向GenBank提交了18条重复序列,其中4条含有LINEs序列片段,4条含有SINEs序列片段,3条含有卫星序列片段,4条含有简单重复序列片段,1条含有LTR-逆转录转座子片段,2条未知功能的重复序列。
[期刊] 中国农业科学
[作者]
韦克苏 程方民 董海涛 张其芳 刘奎刚 曹珍珍
【目的】揭示花后高温条件下水稻灌浆过程中胚乳淀粉和蛋白贮藏物代谢相关基因的表达谱,并阐明部分重要功能基因对花后高温胁迫的响应表达模式。【方法】利用人工气候箱设高温(日均温度32℃,日最高温36℃/日最低温28℃)和适温(日均温度22℃,日最高温26℃/日最低温18℃)2个温度处理,并在水稻开花后的不同时期取样,对水稻胚乳贮藏物代谢各类相关基因的表达谱与表达模式进行高通量的cDNA微阵列检测。【结果】在水稻胚乳贮藏物代谢的相关基因中,以对高温胁迫响应表现较迟钝的基因居多,其高温处理与低温处理之间的杂交信号(nARVOL)比值(称R值)大致在0.8—1.2,但随高温处理时间的持续,呈上调或下调差异...
[期刊] 中国水产科学
[作者]
佟广香 鲁翠云 匡友谊 梁利群 尹家胜 孙效文
采用磁珠富集法构建哲罗鱼(Hucho taimenPallas)基因组微卫星文库。哲罗鱼基因组DNA经MboI限制性内切酶消化后,选取400~900 bp的片段,用生物素标记的简单重复序列(ACA)15作探针与其杂交,杂交复合物结合到包被有链霉亲和素的磁珠上,获得目的片段,连接T载体克隆,构建基因组微卫星富集文库。再用同位素标记的(ACA)15探针进行二次筛选,筛选出686个阳性克隆,阳性克隆率为35.94%。对其中140个阳性克隆进行测序,共获得149个微卫星序列,4个小卫星序列,其GenBank Accession Number为DQ110955~DQ121108。其中perfect(完美...
关键词：
哲罗鱼 微卫星 磁珠富集
[期刊] 中国农业科学
[作者]
赵静雯 王加启 赵圣国 孙鹏 卜登攀 胡小丽 卢玉飞 王丹丹 金迪
【目的】研究奶牛瘤胃内参与蛋白质降解过程中二肽基肽酶Ⅳ(dipeptidyl peptidasesⅣ,DPP-Ⅳ)的序列特征和酶学性质。【方法】从奶牛瘤胃微生物Fosmid文库中挑选17 664个克隆,利用dpp-Ⅳ简并引物筛选含dpp-Ⅳ的阳性克隆。提取阳性克隆的质粒,用限制性内切酶HindⅢ进行酶切。PCR扩增含dpp-Ⅳ目的片段,并克隆测序。对阳性克隆的Fosmid末端进行测序。提取阳性克隆粗酶液,利用底物Gly-Pro-pNA检测肽酶活性。【结果】筛选后获得10个含有dpp-Ⅳ的阳性克隆(命名为DP1—DP10)。Fosmid末端序列经BLASTX比对后发现78%的序列可以与数据库的已...
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