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[期刊] 西南农业学报
[作者]
陈明 李超 王瑞 李莉萍 甘西 余晓丽 雷爱莹 黄婷 陈福艳 梁万文
为大规模快速克隆罗非鱼细胞免疫功能基因,采用SMART技术,构建了尼罗罗非鱼链球菌疫苗免疫后外周血白细胞全长cDNA文库。提取免疫后第3、5和7天外周血白细胞总RNA,用PowerscripTM反转录酶逆转录合成第一链cDNA,LD-PCR扩增获得双链cDNA,经SfiI酶切和CHROMASPIN-400TM柱分级分离,收集500 bp以上的片段重组于改造的pBluescript II SK载体并转化大肠杆菌DH5α,测定文库滴度、重组率及库容量。结果表明,构建的cDNA文库原始库容量1.021×106克隆,文库滴度1.078×106pfu/mL,重组率94.71%,插入片段大小0.75~3....
[期刊] 西南农业学报
[作者]
李超 陈明 李莉萍 黄维义 余晓丽 黄婷 张彬 雷爱莹 陈福艳 梁万文
为筛选罗非鱼链球菌疫苗免疫前后白细胞表达变化基因及探讨鱼类白细胞免疫机理,利用抑制性差减杂交(SSH)技术,以链球菌疫苗免疫前后罗非鱼白细胞cDNA为材料,构建了罗非鱼免疫前后正、负2个cDNA差减文库,并采用地高辛(DIG)标记差减文库cDNA作为探针,进行差异表达片段的筛选鉴定。结果显示:2个文库重组率均在90%以上,插入片段在300～900 bp,接头连接效率超过50%,差减效率非常高效,阳性率均超过70%。杂交筛选后正、负文库各挑选30个阳性克隆进行测序组装聚类,正、负文库各获得16和18条非冗余EST(unigene),所得序列经GenBank同源性分析,正、负文库各有10和11条u...
[期刊] 水产学报
[作者]
卢强 丰培金 李莲瑞 付宝权 刘明远
Leukocytes are key cells for the specific and nonspecific immune systems, it expresses different kinds of biodefense-related peptides and proteins including specific and nonspecific antimicrobial agents, and activators and regulators of the immune system. However,we know very little about the cellul...
关键词：
鲤 外周血白细胞 cDNA文库
[期刊] 淡水渔业
[作者]
李超 陈明 黄维义 王瑞 余晓丽 黄婷 雷爱莹 梁万文
应用Trizol一步法对尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)外周血白细胞总RNA提取方法进行优化,通过β-ac-tin基因反转录对所分离到的总RNA进行质量验证,并对mRNA的冻干浓缩进行了探讨,确定了一套快速、高效的尼罗罗非鱼外周血白细胞总RNA分离和mRNA浓缩体系。结果显示:获得的总RNA纯度较高,OD260/OD280均在1.9~2.0之间;甲醛变性电泳显示,总RNA完整性良好,28S与18S比值为2∶1;总RNA的分离量与起始白细胞量成正比,每毫升Trizol最大裂解量为1×108个白细胞,可得到总RNA量约为90μg;总RNA的分离量在前四个小时随着沉淀时间的增...
[期刊] 上海水产大学学报
[作者]
何学军 李思发
用Stratagene技术构建了吉富品系尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus,GIFT strain)肝cDNA文库。首先用TRIZOL法提取肝总RNA,经琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度检测,表明总RNA纯度高且完整性良好。然后分离纯化mRNA,合成双链cDNA之后,加EcoRⅠ接头、EcoRⅠ末端磷酸化、XhoⅠ消化,并用葡聚糖凝胶柱层析分级收集cDNA样品,得到300 mg cDNA,符合建库要求。双链cDNA与Uni-ZAP XR Vector连接后,用GigapackⅢGold Packaging Extract进行体外包装得到cDNA文库。测得的文库滴度为1.25×1...
关键词：
尼罗罗非鱼 肝 cDNA文库
[期刊] 水产学报
[作者]
付保忠 卢强 谭业平 孙晓义 李伟 刘相叶 邓洪宽
采用基因文库筛选方法,克隆了鲤外周血白细胞蛋白酶体激活因子PA28βcDNA,对其序列进行了分析,同时利用半定量反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)方法检测了不同外界因子刺激下鲤外周血白细胞PA28β的表达情况。结果显示,用DD-RTPCR的方法获得差异显示片段A18,经地高辛标记作为探针对有丝分裂原刺激的鲤外周血白细胞cDNA文库进行核酸杂交筛选,从0.8×104个重组噬菌体中,经过两轮筛选获得阳性克隆。序列分析表明,该阳性克隆长1175bp,含有一个大小为735bp编码244个氨基酸的完整开放阅读框,为编码鲤鱼蛋白酶体激活因子PA28β的全长cDNA。系统发生分析其与已报道的斑马鱼蛋白酶体...
[期刊] 华北农学报
[作者]
陈明 王秋华 王瑞 甘西 李莉萍 雷爱莹 梁万文 黄维义
利用酵母重组分泌表达的罗非鱼HSP70与海豚链球菌抗原在体外非共价结合形成HSP70-抗原复合物,通过体外增殖试验及免疫相关基因表达检测研究HSP70对罗非鱼外周血淋巴细胞免疫功能的影响。结果表明,tHsp70在体外能够与海豚链球菌菌体、胞外分泌物(ECP)结合形成HSP70-抗原复合物。tHsp70(10μg/mL)或tHsp70(10μg/mL)-菌体复合物均可极显著刺激罗非鱼淋巴细胞增殖(P
[期刊] 水产学报
[作者]
殷志新 翁少萍 叶巧真 何建国
用Tripure试剂盒提取斜带石斑白细胞总RNA ,反转录合成第一链cDNA ,进行长距离PCR ,蛋白酶K消化 ,SfiI酶切 ,通过CHROMASPIN - 4 0 0柱 ,回收大于 5 0 0bp的cDNA ,与λTripIEx2载体连接 ,体外包装后构建了斜带石斑白细胞的cDNA文库。库容 1.6 5× 10 6,重组频率 82 % ,扩增后滴度 7.5× 10 9pfu·mL-1。插入片断长度 5 0 0～ 2 30 0bp ,最多的是在 75 0～ 10 0 0bp范围。本文库可作为筛选斜带石斑细胞因子基因的重要资源
[期刊] 海洋水产研究
[作者]
王维新 史成银 黄倢
利用SMART (SwitchingMechanismat 5’endofRNATranscript)技术 ,以同源重组的方式构建了中国明对虾鳃细胞的全长cDNA文库。首先用RNA提取试剂盒从中国明对虾鳃细胞中提取总RNA ,以总RNA为模板 ,CDSⅢOligo(dT)为引物 ,反应一段时间后 ,再加入转换模板 (Switchingtemplate) ,反转录合成cDNA第 1链。在DNA聚合酶的作用下 ,通过长距离PCR ,扩增双链DNA。双链cDNA经凝胶过滤柱纯化后 ,与线性化的 pGADT7 Rec质粒载体同源重组 ,转化感受态AH10 9酵母菌株后 ,得到中国明对虾鳃细胞的全长cD...
[期刊] 中国水产科学
[作者]
段亚飞 刘萍 李吉涛 李健 陈萍
采用SMART技术(Switching Mechanism At 5′end of RNA Transcript)构建了脊尾白虾(Exopalaemon carini-cauda)血细胞全长cDNA文库。结果表明:cDNA初级文库滴度为2.8×106pfu/mL,重组率达99%以上,插入片段在400~2 000 bp;扩增文库滴度为4.3×109pfu/mL。随机挑取100个单克隆进行测序,得到95条平均长度为493 bp的高质量EST序列,序列拼接获得70条unigenes,包括11条contigs和59条singlets。Blast同源比对发现,其中20条unigenes与数据库中已知基因...
[期刊] 海洋渔业
[作者]
申望 叶茂 石戈 王日昕
三疣梭子蟹是我国沿海重要养殖品种之一,近年来养殖病害呈逐年上升趋势,制约了三疣梭子蟹养殖产业的健康可持续发展。为大规模克隆三疣梭子蟹免疫相关基因,研究其免疫基因的功能和免疫机制,奠定三疣梭子蟹病害防治理论基础,采用SMART技术构建了三疣梭子蟹血细胞全长cDNA文库。经测定,文库滴度为1.14×107pfu/mL,文库总容量为5.7×107pfu,重组率达到98%,插入片段平均长度为817.5 bp。文库随机测序获得的70个全长cDNA,从中发现18个已知基因和5个未知基因。已知基因主要为多肽/蛋白质合成相关基因,共9个;免疫相关基因4个,分别是抗菌肽hyastatin、C-reactive ...
[期刊] 中国水产科学
[作者]
杨星 刘文枝 肖汉兵 孟彦 高正勇 张辉 曾令兵
以福尔马林灭活的嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)作为免疫原(F-AH),通过腹腔注射免疫健康大鲵(Andrias davidianus),分别于免疫后的第1、4、7、14、21、28天采集血液样品,进行大鲵外周血液的血细胞计数与白细胞组成分析,测定吞噬细胞的吞噬活性以及血清中和抗体效价,于免疫28 d后进行攻毒感染试验。结果表明,与对照组相比,在免疫后第4、7、14和第21天,免疫大鲵外周血中血细胞数量显著增加,其中,红细胞和白细胞数量均于第4天达峰值,分别为7.83×107个/mL和6.74×106个/mL;嗜中性粒细胞百分比也在第4天达峰值,为28.60%,单核细胞...
[期刊] 中国农业科学
[作者]
王继英 王彦平 王怀中 王海飞 刘剑锋 郭建凤
【目的】聚肌胞(Poly I:C)是聚肌苷酸和聚胞苷酸的共聚物,能够模拟病毒感染后所形成的ds RNA,刺激机体产生抗病毒免疫反应和炎症反应。利用Poly I:C作为免疫刺激剂对猪外周血单核细胞(Peripheral blood mononuclear cells,PBMC)的免疫刺激试验中Poly I:C的最佳作用浓度和体外免疫刺激培养时间的研究还未见报道。本研究探讨不同的Poly I:C免疫剂量和免疫刺激时间对猪PBMC各细胞因子和受体基因表达的影响,确定Poly I:C进行免疫试验的最佳作用浓度和体外免疫刺激培养时间,为利用Poly I:C进行RNA病毒感染的免疫应答调控机理研究提供试验...
[期刊] 淡水渔业
[作者]
耿青 肖炜 李大宇 邹芝英 祝璟琳 杨弘
以尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)为对象,采用体内注射植物血细胞凝集素(PHA)方式收集有丝分裂后期的鱼体头肾细胞,低渗法制片,运用激光显微分离获得尼罗罗非鱼1号染色体,分离后的单染色体通过特异性酶切和LA-PCR体外扩增,得到500~2 000 bp之间的DNA片段,并通过Southern blot和微卫星标记得到验证。扩增片段通过电泳回收、连接转化、感受态细胞培养等步骤构建尼罗罗非鱼1号染色体微克隆文库,克隆片段长度在300~600 bp之间。
[期刊] 福建农林大学学报(自然科学版)
[作者]
杨倩 包涛涛 鲜思美 张友 梁倩 顾庆林
为筛选与羊口疮病毒(OrfV)蛋白相互作用的宿主细胞蛋白，构建了羔羊睾丸(LT)细胞酵母双杂交cDNA文库.采用Trizol法提取LT细胞总RNA,运用SMART技术经LD-PCR合成全长cDNA,再经同源重组法将pGADT7-Rec载体与cDNA共转化至Y187酵母菌株，利用营养缺陷型选择性培养基(SD/-Leu)筛选阳性克隆，并鉴定文库质量.结果显示：LT细胞酵母双杂交cDNA文库构建成功，其文库滴度为2.33×10~8 CFU·mL~(-1),文库容量达3.5×10~9 CFU;随机挑选34个单克隆进行PCR检测，插入片段大小为250～2 000 bp,平均大小约为1 000 bp,文库重组率达100%.由此表明，本文库达到高质量文库条件，可作为研究OrfV与宿主细胞间互作机制的生物材料.
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