捕食线虫性真菌少孢节丛孢菌在侵染线虫的过程中分泌几丁质酶,为了弄清少孢节丛孢菌几丁质酶基因AO-190的分子特征和功能,对少孢节丛孢菌新疆分离株XJ-A1几丁质酶AO-190进行克隆及分子特征分析,构建原核表达载体p ET32a-AO-190进行表达,并利用镍柱纯化技术纯化重组几丁质酶后,使用几丁质酶ELISA检测试剂盒测定酶活性。结果显示,XJ-A1几丁质酶AO-190基因全长1 574 bp,有4个内含子序列,序列中包含1个1 251 bp的开放阅读框(ORF),编码416个氨基酸,与少孢节丛孢菌标准株(ATCC 24927)的几丁质酶AO-190基因序列的同源性为93. 33%,氨基酸序列的同源性为92. 55%;有信号肽以及1个精氨酸富集区、1个双向核定位信号、1个N-糖基化位点、4个PKC磷酸化位点、6个N-酰基化位点、8个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点、1个酰胺化位点、1个低复杂度区,且含有糖苷水解酶18家族几丁质酶保守的底物结合位点SLGG和催化活性位点VDGVDLDLE,属于糖苷水解酶18家族几丁质酶;其二级结构元件有无规则卷曲、α螺旋和β折叠,三级结构为(α/β)8圆桶形结构;系统进化分析表明,AO-190与能产生短柄黏球的Dactylellina haptotyla的几丁质酶(EPS43772. 1)以及能产生收缩环的Drechslerella stenobrocha(EWC46603. 1)几丁质酶亲缘关系最接近,与昆虫和脊椎动物的几丁质酶存在显著的进化距离;经SDS-PAGE和Western Blot分析,原核表达获得的重组蛋白酶分子量约为63 ku,与预期大小一致,且能与小鼠抗少孢节丛孢菌多克隆抗体发生特异性血清学反应;几丁质酶酶联免疫分析(ELISA)检测,经镍柱纯化技术纯化后的重组几丁质酶活性浓度为222 IU/L。

在构建好蜡梅花cDNA文库并进行EST分析基础上,通过随机克隆测序,得到1个蜡梅几丁质酶的cDNA基因,命名为Cpchia(GenBank登录号:FJ749130)。CpchiacDNA全长为1184bp,开放阅读框为954bp,编码317个氨基酸,其结构包括信号肽、几丁质结合域、可变交联区、催化区,无C端延伸区,为ClassⅠb型胞外几丁质酶,属于几丁质酶第19家族。将Cpchia克隆到原核表达载体pET-28a(+),在大肠杆菌BL2l细胞中以包涵体形式表达融合蛋白,利用透析法获得复性蛋白,其几丁质酶活性经DNS法检测达到200U.mL-1。酶活性和稳定性分析表明,试验条件下,pH7.0有...

为研究卵寄生真菌在寄生并破坏卵的过程中几丁质酶的作用,本研究从烟草南方根结线虫卵上分离得到虫草棒束孢HNE3,采用RT-PCR及RACE技术,首次克隆得到一个几丁质酶基因IFCHI1。该基因DNA序列全长1 417 bp,具有1个内含子,长度为61 bp,包含1个1 185 bp的开放阅读框(ORF),编码1个由394个氨基酸组成的蛋白。通过在线软件分析,该蛋白理论分子量为44.1 k Da,等电点为4.88。通过Gen Bank比对,几丁质酶IFCHI1属于第18家族糖基水解酶,比对分析不同来源真菌几丁质酶,发现该几丁质酶具有典型的催化区保守序列SIGGW和FDGIDIDWE及结合区保守序列...

根据GenBank中少孢节丛孢菌丝氨酸蛋白酶P186基因序列设计特异性引物,运用RT-PCR扩增获得目的基因片段,构建重组表达质粒pET32a-P186,转化到大肠杆菌BL21(DE3),以IPTG进行了诱导表达。结果表明,P186基因cDNA全长为1 224 bp,编码407个氨基酸,其中第1~21位为信号肽序列,氨基酸序列的第156~167位、192~202位、343~353位分别是天冬氨酸(Asp160)、组氨酸(His192)、丝氨酸(Ser345)活性位点所在区域,属于Subtilase家族,包括2个潜在的N-联糖基化位点(Asn249、Asn342)及与底物结合的S1区(SBP)S...

利用PCR方法从产酶溶杆菌OH11菌株中克隆到编码几丁质酶的chiA基因。同源性比较发现,其推测产物与产酶溶杆菌C3菌株和N4-7菌株的ChiA有97%以上的序列一致性。基因经NdeⅠ和XhoⅠ双酶切后连接到含T7启动子的高表达载体pET21a(+)上构建重组质粒pChiA,并转化宿主菌BL21(AI)产生BLChiA表达菌株。经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导后发现,BLChiA菌株产生相对分子质量约为75×103的蛋白质。生物活性试验表明,该蛋白能水解几丁质,在几丁质培养基上产生一透明的水解圈,并对立枯丝核菌菌丝的生长有抑制作用。因此该蛋白具有一定的生物防治作用。

【目的】克隆中国水仙几丁质酶基因,分析其在水仙不同组织中的表达,为提高中国水仙的抗病性提供参考。【方法】利用RT-PCR技术克隆得到中国水仙几丁质酶基因,对其序列及编码氨基酸序列进行生物信息学分析,通过qRT-PCR分析该基因在感染基腐病、病毒病及褐斑病中国水仙根、叶中的表达。【结果】中国水仙几丁质酶基因的cDNA序列长768bp,编码230个氨基酸,其编码蛋白的分子质量为25.4ku,理论等电点为9.04,为不稳定蛋白,亲水性强,二级结构以α螺旋和无规则卷曲为主。该基因编码的蛋白与荷兰芹几丁质酶蛋白的亲缘关系最近,隶属于糖苷水解酶19家族,与溶菌酶相似超家族基因的保守结构域类似,推测其可能是...

克隆渐狭蜡蚧菌几丁质酶基因,为进一步明确该菌产生的几丁质酶对定居性根结类和孢囊类线虫卵孵化抑制作用提供理论依据。采用分离自黑龙江大豆孢囊线虫孢囊寄生真菌CGMCC5328,通过形态学特征及ITS序列比较分析,鉴定该菌株为渐狭蜡蚧菌。通过简并引物设计和RACE技术,克隆渐狭蜡蚧菌中几丁质酶基因,利用生物学软件分析该基因序列及其编码的氨基酸序列。首次从渐狭蜡蚧菌中克隆得到一个几丁质酶基因LACHI1,该基因DNA序列长1 743 bp,含3个内含子,包含1 272 bp开放阅读框,编码423个氨基酸,理论分子量45.9 kDa,等电点5.90。LACHI1基因编码的几丁质酶,属于糖基水解酶18家族...

通过对粉虱、小菜蛾高效的球孢白僵菌HFW-05几丁质酶基因的克隆及序列分析,旨在从分子水平上了解HFW-05菌株的几丁质酶特性。根据已发表的几丁质酶基因序列(EU828354)设计几丁质酶基因全长引物,扩增HF-WBbchit1全长基因,与大肠杆菌(Escherichia coli)克隆载体pMD19-T连接获得含有HFWBbchit1全长基因的重组质粒pMDchit1并测序。该基因的编码区包括1 047 bp,编码了348个氨基酸,分子量约为36.795 kDa,进行同源性比较分析结果表明:其基因序列与球孢白僵菌菌株NCIM1216几丁质酶基因(EU828354)和球孢白僵菌菌株Bb0062...

采用逆转录聚合酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ）和Ｃ ＤＮＡ末端快速扩增（ＲＡＣＥ）技术，依据锯缘青蟹（ＳＣｙｌｌＡ ＳＥＲＲＡＴＡ）几丁质酶基因的保守区设计引物，克隆了中华绒螯蟹（ＥＲｉｏＣｈＥｉＲ ＳｉＮＥＮＳｉＳ）几丁质酶基因（ｈＸＣｈｉＴ）全长，并通过荧光定量ＰＣＲ（ｑ ＲＴ－ＰＣＲ）技术研究了ｈＸＣｈｉＴ在中华绒螯蟹的同一蜕皮阶段不同组织、不同蜕皮阶段主要几个组织的表达情况。结果显示，ｈＸＣｈｉＴ基因Ｃ ＤＮＡ全长２ ０４２ ｂＰ（ＧＥＮ ｂＡＮｋ ＡＣＣＥＳＳｉｏＮ Ｎｏ．ｋＪ５１３４６６），包括５′非编码区（５′ＵＴＲ）３５ ｂＰ，３′非编码区（３′ＵＴＲ）５３７ ｂＰ，开放阅读框（ｏＲＦ．．．

为探究几丁质酶基因在三疣梭子蟹蜕皮过程中的生理作用,本研究通过转录组测序和RACE技术克隆了三疣梭子蟹几丁质酶基因(Pt Chi)c DNA全长(登录号:KF914663),并通过荧光定量PCR(qRT-PCR)技术研究了该基因在三疣梭子蟹不同组织及不同蜕皮阶段的表达情况。结果表明:(1)Pt Chi基因c DNA全长2 200 bp,包括5'非编码区(5'-UTR)16 bp、3'非编码区(3'-UTR)714 bp和开放阅读框1 470 bp,编码489个氨基酸,预测蛋白质分子量和等电点为53.97 ku和4.76。(2)Blast P结果显示,Pt Chi推导氨基酸序列与已知甲壳动物Ch...

罗氏沼虾的生长发育及繁殖都与蜕皮紧密相关。几丁质酶是甲壳动物在蜕皮过程中最重要的酶之一。本研究对罗氏沼虾蜕皮周期外观特征和腹肢刚毛进行了观察描述,克隆并分析了罗氏沼虾的几丁质酶Ⅲ基因(MrChi3B),制备了几丁质酶Ⅲ蛋白的多克隆抗体,研究了其在蜕皮周期中的表达。罗氏沼虾几丁质酶基因cDNA的开放阅读框为1 143 bp,编码380个氨基酸,大小为41.91 ku。通过氨基酸序列比对发现,MrChi3B与日本沼虾几丁质酶基因(Chi3B)的同源性最高,为94%。MrChi3B含有一个糖苷键水解酶家族18的催化域。实时定量PCR (qRT-PCR)和蛋白印迹法(WB)检测结果显示,MrChi3B在罗氏沼虾多个组织中均有表达,但是不同组织中的表达有差异。在蜕皮期之后,其在胃、表皮和肌肉中的表达量显著上升。在胃中其表达量在蜕皮间期达到最高;在表皮和肌肉中其表达量在蜕皮后期达到最高;肠中的表达量在蜕皮前期和蜕皮期有所上升;眼柄期的表达量在所有蜕皮期都偏低。本研究结果为进一步研究几丁质酶的功能提供参考依据。

采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和c DNA末端快速扩增(RACE)技术,依据锯缘青蟹(Scylla serrata)几丁质酶基因的保守区设计引物,克隆了中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)几丁质酶基因(HXchit)全长,并通过荧光定量PCR(q RT-PCR)技术研究了HXchit在中华绒螯蟹的同一蜕皮阶段不同组织、不同蜕皮阶段主要几个组织的表达情况。结果显示,HXchit基因c DNA全长2 042 bp(Gen Bank accession no.KJ513466),包括5′非编码区(5′UTR)35 bp,3′非编码区(3′UTR)537 bp,开放阅读框(ORF...

［目的］通过表达载体ｐ ＥＴ－２８ａ（＋）在大肠杆菌中克隆表达蜜蜂螺原体ＳｐｉｒｏｐｌａＳｍａ ｍＥｌｌｉｆＥｒｕｍ ＣＨ－１中可能与致病相关的几丁质脱乙酰酶（ＣＨｉＴｉｎ ｄＥａＣＥＴｙｌａＳＥ，Ｃｄａ）基因ＣＨｉｄ，并测定其部分酶学性质，为进一步研究该基因在蜜蜂螺原体致病过程中的作用奠定基础。［方法］利用ｏｖＥｒｌａｐ ＥｘＴＥｎＳｉｏｎ ｐＣｒ（ｏＥ－ｐＣｒ）定点突变技术，在引物设计时插入目的突变，通过３次ｐＣｒ获得突变后的目的片段，测序验证后构建重组质粒ｐ ＥＴＣＨｉｄ，挑取ＢｌＣＨｉｄ表达菌株。ｉｐＴＧ诱导表达目的蛋白，ｎＴａ－ｎｉ２＋柱纯化，ＷＥＳＴＥｒｎ ＢｌｏＴＴｉｎＧ验证，紫．．．

为了解日本沼虾几丁质合成酶(Chs)基因在蜕皮过程中的作用,本实验采用RACE技术首次从表皮中克隆了几丁质合成酶基因(Mn Chs)c DNA全长,并用生物软件对其序列进行生物信息学分析,RT-PCR技术检测该基因的时空表达模式。结果表明,其c DNA全长5 133bp,5'UTR为283 bp,3'UTR为159 bp,开放阅读框(ORF)长度为4 701 bp,编码1 566个氨基酸,分子量为179.57 ku,理论等电点为6.09,包含2个几丁质合成酶的标签序列EDR和QRRRW及Chitin-synth-C结构域。经BLAST比对,与日本仿长额虾、淡水枝角水蚤Chs相似性分别为89%和...

【目的】探究春尺蠖（Apocheima cinerarius）响应逆境胁迫的分子机理，并挖掘与低温和饥饿胁迫相关的主要关联基因，为进一步揭示春尺蠖响应逆境胁迫的分子机理奠定基础。【方法】基于已测春尺蠖3龄幼虫在不同温度及4龄幼虫在不同时间饥饿胁迫的转录组数据，克隆获取了几丁质酶基因，命名为AcinCht10（基因登录号：OK504624），分析了该基因的分子特征及其氨基酸的基本理化性质，进行序列比对并构建了系统进化树，并分析了该基因在逆境胁迫（低温和饥饿）下的表达谱。【结果】春尺蠖AcinCht10基因预测分子式为C_(5017)H_(7689)N_(1349)O_(1490)S_(39)，编码蛋白区全长2967 bp，共编码988个氨基酸，蛋白的预测分子量111.99 kDa，理论预测等电点为6.25，该蛋白的亲水性系数为-0.547，预测不稳定系数值为37.19，为稳定亲水性蛋白；发现1条信号肽，未发现跨膜结构；发现2个催化区和1个几丁质结合域；磷酸位点检测发现丝氨酸48个，苏氨酸43个，酪氨酸14个，未检测到糖基化位点。序列比对结果显示，春尺蠖AcinCht10与其它鳞翅目昆虫的几丁质酶基因氨基酸一致性较高，均在91%以上；系统进化结果显示，搜索获取昆虫的几丁质酶基因分别聚为8类（I～VIII型），同时春尺蠖AcinCht10与同为鳞翅目昆虫的烟草天蛾（Manduca sexta）Cht10、粉纹夜蛾（Trichoplusia ni）Cht10和亚洲玉米螟（Ostrinia furnacalis）Cht10聚为一类。基因表达分析结果显示，AcinCht10基因随着饥饿处理时间的增加，表达量依次降低且相邻处理间的表达量差异不显著。AcinCht10基因在25 ℃处理下表达量最高，而在其余温度胁迫下表达量均处于较低水平且差异不显著。【结论】AcinCht10基因与春尺蠖应对低温及饥饿胁迫的响应密切相关。该结果有助于揭示春尺蠖几丁质酶基因在逆境胁迫下的分子功能，为进一步揭示春尺蠖响应逆境胁迫的分子机理奠定基础。