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[期刊] 华北农学报
[作者]
赵海龙 孟庆玲 乔军 陈双庆 王国超 谢堃 胡政香 才学鹏
根据GenBank中少孢节丛孢菌丝氨酸蛋白酶P186基因序列设计特异性引物,运用RT-PCR扩增获得目的基因片段,构建重组表达质粒pET32a-P186,转化到大肠杆菌BL21(DE3),以IPTG进行了诱导表达。结果表明,P186基因cDNA全长为1 224 bp,编码407个氨基酸,其中第1~21位为信号肽序列,氨基酸序列的第156~167位、192~202位、343~353位分别是天冬氨酸(Asp160)、组氨酸(His192)、丝氨酸(Ser345)活性位点所在区域,属于Subtilase家族,包括2个潜在的N-联糖基化位点(Asn249、Asn342)及与底物结合的S1区(SBP)S...
[期刊] 西南农业学报
[作者]
赵海龙 孟庆玲 乔军 陈双庆 谢堃 罗建勋 才学鹏
本研究在国内首次对少孢节丛孢菌新疆分离株(XJ-A1)丝氨酸蛋白酶家族相关基因P12、P186和P233进行了扩增、克隆及测序,对其编码蛋白信号肽、疏水性与亲水性、高级结构、功能域进行预测和分析。结果显示:3个不同的丝氨酸蛋白酶均含有信号肽和天冬氨酸(D)、组氨酸(H)和丝氨酸(S)3个活性位点,表明它们均属于胞外分泌性Subtilase家族;同时,都含有2个潜在的N末端糖基化位点及2个与底物结合的S1区。系统发生分析发现,P12、P186和P233与其他不同地域、不同种属的丝氨酸蛋白酶基因亲缘性较远。本研究为研发预防动物消化道线虫的生物防控奠定了前期基础。
[期刊] 水产学报
[作者]
储卫华 陆承平
根据已发表的气单胞菌胞外蛋白酶基因核苷酸序列,设计和合成了一对引物,以嗜水气单胞菌AhJ-1的基因组DNA为模板,通过PCR技术,扩增到约900bp的丝氨酸蛋白酶基因片段,并克隆到质粒载体pGEM-T中进行测序和分析,结果表明扩增的丝氨酸蛋白酶基因片段与已发表的嗜水气单胞菌丝氨酸蛋白酶Ahe2的同源性有87％,扩增片段编码343个氮基酸,推测的分子量为35700,计算机软件分析表明编码的氨基酸有较高的抗原性,可作为核酸疫苗的侯选基因片段。
关键词：
嗜水气单胞菌 丝氨酸蛋白酶基因 克隆
[期刊] 上海海洋大学学报
[作者]
沈锦玉 李新华 潘晓艺 尹文林 曹铮
中华鳖(Trionyx sinensis)细菌性疾病主要由气单胞菌感染引起的,通过脱脂奶平板检测及酶活性试验得出温和气单胞菌TL97528株分泌的胞外蛋白酶为丝氨酸蛋白酶,而丝氨酸蛋白酶是气单胞菌的主要毒力因子。根据已发表的嗜水气单胞菌的丝氨酸蛋白酶基因序列保守区域设计引物,PCR扩增出一长度为809 bp大小的特异片段,该序列在Genbank上的登录号为FJ357446。对该序列进行分析发现,已发表的温和气单胞菌(Aeromonas sobria)丝氨酸蛋白酶基因(GenBank登录号为AF253471)同源性为98%、与其他几株已发表的嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila...
[期刊] 华北农学报
[作者]
王瑞 王军 杨晓野
为了比较不同地理株的捕食线虫性真菌-少孢节丛孢菌丝氨酸蛋白酶基因的同源性,首先利用Biospin真菌基因组DNA提取试剂盒,提取少孢节丛孢菌内蒙古株(Arthrobotrys oligospora CHIM)的DNA,然后根据GenBank中相应丝氨酸蛋白酶基因,分别设计上下游引物;再经PCR扩增后,纯化并回收扩增产物,然后进行序列测定并分析。结果表明:少孢节丛孢菌内蒙古株丝氨酸蛋白酶基因序列与少孢节丛孢菌瑞典株(AY444597)和少孢节丛孢菌云南株(AF516146)同源性分别为80.3%和84.1%;虽然这3株菌具有较高的亲缘性,但其差异也非常明显,这一结果说明少孢节丛孢菌在不同国家或地...
[期刊] 西南农业学报
[作者]
王宇 王中康 廖玉凤 殷幼平
丝氨酸蛋白酶是眼斑芫菁消化系统内重要的消化酶,为了更好地了解丝氨酸类蛋白酶在芫菁消化系统中的作用,本研究利用5'cDNA末端快速扩增(5'RACE)和3'RACE的方法获得该基因的全长cDNA序列,登录号为KC954650。该基因的开放阅读框长816 bp,编码271个氨基酸,预计分子质量为28.22kDa,pI为5.09,预测分子式为C1255H1975N321O400S8,不稳定系数为23.35,总亲水性系数为0.286,为疏水性稳定蛋白。序列分析表明该基因编码的蛋白含有丝氨酸蛋白酶的保守功能位点,与赤拟谷盗在系统进化关系上最近。本研究首次从眼斑芫菁体内克隆得到丝氨酸蛋白酶基因,为后期研究...
关键词：
丝氨酸蛋白酶 眼斑芫菁 RACE
[期刊] 中国水产科学
[作者]
李洋 刘萍 李健 李吉涛 马朋 高保全
采用RACE方法获得了脊尾白虾(Exopalaemon carinicauda)丝氨酸蛋白酶抑制剂serpin基因的cDNA序列。该基因全长1 516 bp,开放阅读框1 245 bp,编码414个氨基酸,其预测分子量为45.06 kD,理论等电点为5.694,并含有两个糖基结合位点。同源性分析发现其与斑节对虾(Penaeus monodon)同源性最高,达到49%。组织表达分析表明,serpin基因在脊尾白虾血细胞中表达量最高,其次是肝胰腺和鳃组织,在肌肉中表达量最低。不同盐度胁迫后脊尾白虾的血细胞serpin基因表达量在盐度胁迫8 h时显著高于对照组(P<0.05),肝胰腺组织中serpi...
[期刊] 上海海洋大学学报
[作者]
金凯 牛东红 王劦 李家乐
含有clip结构域的丝氨酸蛋白酶是一类新的丝氨酸蛋白酶家族,可能参与非特异性免疫防御功能。从缢蛏(Sinonovacula constricta)cDNA文库中筛选出一条丝氨酸蛋白酶同源EST序列,然后通过5'RACE扩增、测序,拼接得到全长为1 228 bp的cDNA序列,包括66 bp的5'非翻译区和160 bp的3'非翻译区,以及1 002 bp的开放阅读框。阅读框共编码333个氨基酸,含有17个氨基酸的信号肽序列,并含有发卡结构域(clip domain)和胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶结构域(Tryp_SPc domain)。在clip结构域中包含6个半胱氨酸残基形成的3个二硫键,在Tryp...
关键词：
缢蛏 丝氨酸蛋白酶 序列分析 基因表达
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
胡黎明 曾玲 申建梅 宾淑英 廖泓之 陈高峰 林进添
【目的】克隆桔小实蝇丝氨酸蛋白酶基因(Bactrocera dorsalis serine protease,BdorSer),研究BdorSer在不同组织和不同发育时期的表达情况,探索其可能参与的生理过程。【方法】采用反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)和快速扩增cDNA末端(RACE)技术克隆BdorSer,对其编码蛋白氨基酸序列信息和进化关系进行分析;采用实时荧光定量PCR(real-time PCR)方法,研究BdorSer mRNA在桔小实蝇不同组织及不同发育时期的相对表达量。【结果】克隆获得了BdorSer,该基因ORF全长1 239bp。氨基酸序列一致性分析表明,BdorSer与...
[期刊] 福建农林大学学报(自然科学版)
[作者]
黄天培 潘洁茹 李今煜 洪永聪 黄志鹏
通过设计蛋白酶基因引物,对苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis,简称Bt)库斯塔克亚种菌株8010蛋白酶基因进行克隆,获得了6个蛋白酶基因片段,即中性蛋白酶A、色氨酸合成酶β链、色氨酸合成酶α链、碱性蛋白酶A、磷酸化水解酶和糖原磷酸化酶基因,以及1个未知功能的DNA片段(可能是编码蜡质芽孢杆菌组特有蛋白的基因).
关键词：
苏云金芽孢杆菌 克隆 蛋白酶 序列分析
[期刊] 华北农学报
[作者]
连凯琪 纪爽 周玲玲 时志琪 王飞 张元臣
为了克隆黏虫丝氨酸蛋白酶的全基因序列，并进行原核表达，以黏虫为研究对象，利用RT-PCR扩增丝氨酸蛋白酶的部分基因，进而通过RACE技术，得到丝氨酸蛋白酶全基因，通过Blast等软件对获得基因序列和推导的蛋白质序列进行分析，并利用大肠杆菌表达系统对其进行表达。结果表明，成功克隆黏虫丝氨酸蛋白酶全基因，将其命名为MsPG,序列全长2 010 bp,开放阅读框为1 593 bp,编码530个氨基酸，蛋白质分子质量为67.6 ku,等电点为7.63,且具有含6个半胱氨酸的clip结构域，推测其为clip型丝氨酸蛋白酶。MsPG氨基酸序列与其他鳞翅目昆虫序列一致性在70.00%～91.92%,其中与烟芽夜蛾(GenBank登录号：PCG78401.1)序列一致性最高，达到91.92%。成功构建重组质粒pET30a(+)-MsPG,其在大肠杆菌原核表达系统中0.1 mmol/L IPTG诱导下的最佳表达温度是25℃。综上，黏虫丝氨酸蛋白酶MsPG具有丝氨酸蛋白酶家族保守的功能位点，且能够在体外进行原核表达。
[期刊] 渔业科学进展
[作者]
王倩 张雪 陈亚东 沙珍霞
甘露糖结合凝集素相关丝氨酸蛋白酶1 (Mannan-binding lectin associated serine protease 1,MASP1)是补体凝集素途径中起重要作用的激活蛋白。本研究以半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)为研究对象,应用RACE技术和实时荧光定量qRT-PCR技术对半滑舌鳎MASP1基因(Cynoglossus semilaevis MASP1, CsMASP1)进行了克隆和表达模式分析。结果显示,CsMASP1基因c DNA序列全长为2507 bp,5′非编码区长82 bp,3′非编码区长142 bp,开放阅读框长2283 bp,共编码760个氨基酸;CsMASP1基因包含13个外显子和12个内含子,与多数已知鱼类的MASP1基因结构一致;SMART分析显示,CsMASP1包含6个结构域,与哺乳动物、鸟类、其他鱼类的结构域一致;同源比对发现,CsMASP1和鱼类的相似度较高,与金目鲈(Latescalcarifer)的相似性最高,为76%。CsMASP1基因在11种健康组织(血液、脑、鳃、性腺、心脏、头肾、肠、肝、皮肤、脾和后肾)中均有表达,其中,在肝、脾和头肾中表达量较高;鳗弧菌(Vibro anguillarum)感染后,CsMASP1基因在6种免疫组织(血液、鳃、头肾、肠、肝和脾)中呈现不同的表达模式,在6种免疫组织中呈现明显的上调表达,肝的表达峰值出现在感染后24 h;脾和鳃的表达峰值出现在感染后6 h;肠、头肾和血液的表达峰值均出现在感染后12h;随着病原菌感染时间增加,基因表达量逐渐降低并恢复至正常水平。研究表明,CsMASP1基因参与了半滑舌鳎的免疫应答过程,本结果为半滑舌鳎的免疫机理研究奠定了基础。
[期刊] 水产学报
[作者]
刘海燕 杨汝晴 陈玉磊 张凌晶 孙乐常 刘光明 曹敏杰
为探究大黄鱼肌原纤维结合型丝氨酸蛋白酶（MBSP）的性质。本研究采用生物信息学方法对大黄鱼MBSP进行基因检索与筛选，通过分子克隆得到大黄鱼MBSP编码区全长cDNA并构建毕赤酵母表达系统得到重组蛋白质（Lc-rMBSP），分析Lc-rMBSP的酶学性质和二级结构并通过同源建模分析Lc-MBSP的三级结构。结果显示，大黄鱼肌原纤维蛋白中存在MBSP，在55 ℃下活性最高。大黄鱼基因组中注释为类胰蛋白酶的基因有16条，对这些基因与淡水鱼MBSP进行系统进化树分析和多序列比对，得到同源性较高的基因序列（Lc-MBSP）。Lc-MBSP编码区全长735 bp，共编码244个氨基酸残基。通过毕赤酵母重组表达，分离纯化得到分子量约28 ku的重组蛋白质Lc-rMBSP。表达蛋白的最适温度和pH分别为50 ℃和8.0。圆二色谱分析表明，温度对Lc-rMBSP二级结构具有较大的影响。Lc-rMBSP在较宽的温度范围内（40～60 ℃）对MHC具有较高的水解活性。Lc-rMBSP的最适底物为Boc-Leu-Lys-Arg-MCA，并且特异性切割羧基侧的精氨酸残基，而不分解赖氨酸残基。通过同源建模得到Lc-MBSP的三维结构，催化三联体由保守的His-61、Asp-105和Ser-198构成，其底物结合口袋（Ser-192、Gly-215和Ser-225）与类胰蛋白酶的略有不同，这种差异可能是导致Lc-rMBSP与其他胰蛋白酶酶学性质不同的主要原因。本研究可为海水鱼MBSP的研究提供理论参考。
[期刊] 中国农业科学
[作者]
李游山 赵萍 董照明 邹勇 夏庆友 向仲怀
【目的】鉴定新的家蚕蛋白酶抑制剂,探讨其在抵御病原微生物入侵方面的功能。【方法】对家蚕蛋白酶抑制剂BmSPI37进行T-A克隆、多序列比对、系统发育树构建、原核表达、RT-PCR时空表达特征及微生物诱导分析。【结果】克隆、表达了1个新的丝氨酸蛋白酶抑制剂,命名为BmSPI37。时空表达特征分析表明,BmSPI37在家蚕5龄幼虫后期表达量很高,而且在中部丝腺中高量表达;在蛹向蛾的变态发育时期,BmSPI37在雌蚕中的表达量显著高于雄蚕。微生物诱导试验表明,BmSPI37在大肠杆菌、黑胸败血菌、球孢白僵菌感染后,强烈上调表达。【结论】推测BmSPI37与防御病原微生物入侵有关。
[期刊] 华中农业大学学报
[作者]
张玄兵 杜中军 黄俊生 王家保 徐兵强
根据丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶类催化结构域Ⅰ和Ⅸ的氨基酸保守序列设计简并引物,PCR扩增‘紫花芒’杧果嫩绿色叶片基因组DNA。在NCBI中用BlastX比对发现,有6个阳性克隆是抗病基因同源序列,并命名为PK1~PK6,GenBank注册序列号为AY693369~AY693371和AY776277~AY776279。在PK3、PK4和PK6中发现了丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶的9个催化结构域Ⅰ~Ⅸ,而其它3个克隆具有部分结构域。氨基酸序列同源性分析还发现,6个克隆编码的氨基酸序列都与受体样蛋白激酶有较高的氨基酸序列同源性。系统进化树分析还表明它们都是可能的抗病基因同源序列。总之,6个克隆不仅是抗病基因同...
关键词：
杧果 蛋白激酶 抗病基因 同源序列
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